细菌内同源重组构建携带人dmt1基因的重组腺病毒论文

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1、细菌内同源重组构建携带人DMT1基因的重组腺病毒论文【摘要】目的利用细菌内同源重组法构建携带二价金属离子转运蛋白1（DMT1）编码基因的重组腺病毒。方法应用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）从人胚近段小肠中获取人的全长DMT1IRE的cDNA，亚克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV中，形成转移质粒pAdTrackCMVDMT1IRE,在感受态大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy1同源重组，利用卡那霉素抗性平板初步筛选重组质粒阳性克隆，经PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定获得到重组腺病毒载体pAdEasy1DMT1IRE。线性化的重组质粒转染HEK293细胞，

2、获得高滴度的重组腺病毒。结果RTPCR反应扩增出1841bp的片段，重组质粒阳性克隆pAdEasy1DMT1IRE经PacⅠ酶切后获得一大于20kb的大片段和4.5kb的特征性片段，PCR鉴定扩增出DMT1的片段.freelidpAdTrackCMVcontaininggreenfluorescentprotein(GFP)reportergene,folloidpAdTrackCMVDMT1IREbyPmeⅠdigestionandsubsequentcotransformationintoE.coliBJ5183cellsalongidpAdEasy1.Therebi

3、nantplasmidpAdeasy1DMT1IREycinresistance.TherebinationpAdeasy1DMT1IREinalrepeats.PacⅠdigestedpAdEasy1DMT1IREent,plusasmallerfragmentof4.5kbdigestedbyPacⅠ.PCR,shoicroscopy.ConclusionTherebinantadenovirusissuccessfullyconstructedandcanefficientlyexpressDMT1ologousrebination;Rebinantadenoviru

4、s近年来的研究显示，帕金森病（PD）病人脑内有铁代谢的改变，铁离子含量在黑质致密带显著增高，而在黑质网状带无明显变化1,2。但铁在黑质的选择性聚积的原因至今还不是十分清楚。新的铁转运蛋白的发现是铁代谢领域的重大突破，为解释这一问题提供了重要的理论依据。二价金属离子转运蛋白1（DMT1）曾被称为具有天然抗性的巨噬细胞蛋白2（Nramp2），是新近发现的铁转运蛋白3。研究发现DMT1在脑内广泛表达4，提示DMT1在脑铁转运中起到非常重要的作用，可能参与了黑质内的铁聚积。本研究构建了携带DMT1IRE的重组腺病毒，为研究DMT1在铁聚积中的作用提供实验依据，有利于进一步阐明PD的神经元损伤机

5、制。1材料与方法1.1材料实验能用携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV，E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdeasy1，大肠杆菌BJ5183、JM109和DH10B由本室保存。兔抗鼠DMT1IRE单克隆抗体购自AlphaDiagnostic公司。βactin抗体为Sigma公司产品，HRP标记的goatantirabbitIgG购自中山公司。人胚肾293细胞由本室保存。人胚肾293细胞用含体积分数为0.10的胎牛血清、105U/L青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养液，于37℃、体积分数0.05CO2温箱中培养。1.2方法1.2.1RT

6、PCR扩增目的基因应用Trizol提取RNA,应用巢式PCR的方法扩增DMT1IRE基因，外侧引物：5′AGGGTACCTCTAAGAACTCAGCCACTCAG3′，3′GGATACCCGAACACAGAACTTCGAACCA5′；内侧引物：5′AAGGTACCACCATGGTGCTGGGTCCTG3′，3′GTCTGCAAAACTTGTTTTCCGTTTTCGAACG5′。第一轮PCR反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃1min，63℃1min，72℃2min，扩增30个循环；最后72℃延伸10min。将第一轮PCR产物以1∶100稀释后用于第二轮PCR扩增。扩增产物

7、于含溴化乙锭（0.5mg/L）的12g/L的琼脂糖凝胶中电泳进行检测，紫外线透射仪下观察电泳结果。1.2.2载体双酶切将DMT1IRE插入pMD18T载体测序，测序结果显示DMT1IRE序列正确，将载体pMD18TDMT1IRE和pAdTrackCMV分别用限制性核酸内切酶KpnⅠ和HindⅢ双酶切，37℃水浴5h。用10g/L琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，待DNA完全消化后（电泳显示单一条带），回收纯化酶切产物。1.2