细菌内同源重组快速构建和制备表达hsdf

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1、细菌内同源重组快速构建和制备表达hSDF作者：唐俊明,郭凌郧,孔霞,杨建业,潘国栋,陈龙,黄永章,王家宁【关键词】同源重组；人基质细胞源衍生因子　　ConstructionofrebinantadenoviralplasmidbearinghSDF1αcDNAbyhomologousrebinationinbacteriaandpreparationofrebinantadenovirusexpressinghSDF1α　　【Abstract】AIM：ToconstructrebinantadenoviralplasmidcontaininghSDF1αcDNAusinghomologous

2、rebinationinbacteriaandtopreparerebinantadenovirusexpressinghSDF1α.METHODS:AdenoviralbackboneplasmidedintopetentBJ5183andthepetentBJ5183transformedideIdigestionandCIAPdephosphorylationedintothepetentcellsBJ5183transformedidpAdEGFPhSDF1αeLipoVectopackagerebinantadenovirusAdEGFPhSDF1.AdEGFPhSDF1αedin

3、topetentBJ5183transformedologousrebinationbetemediatedtransfectionofpAdEGFPhSDF1αdigesteded.ThepackagingofrebinantadenovirusAdEGFPhSDF1αedbyfluorescentmicroscopy.Theviraltiterpleandrapidhomologousrebinationinbacteria.Thisstudyprovidesabasisforexploringthemigrationmechanismofbonemarrocellsintoinjure

4、dtissuesuchasinfarctedmyocardium.　　【Keyologousrebination；hSDF1α；adenovirus；genetherapy　　【摘要】目的：利用细菌内同源重组快速构建携带hSDF1αcDNA重组腺病毒质粒和制备表达hSDF1α重组腺病毒.方法：制备感受态BJ5183，将pAdEasy1转化BJ5183，制备含pAdEasy1的BJ5183感受态，将线性化的pShuttleEGFPhSDF1α转化含pAdEasy1的BJ5183感受态菌.采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒pAdEGFPhSDF1α.pAdEGFPhSDF1α用PacI线性化

5、后，再用LipoVec介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEGFPhSDF1α.采用荧光显微镜下观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况.结果：pShuttleEGFPhSDF1α成功地转化了含pAdEasy1的BJ5183，并在其内发生了同源重组.荧光显微镜下观察证实了pAdEGFPhSDF1α转染AD293后，产生了重组腺病毒AdEGFPhSDF1α.病毒滴度为4.1×1015pfu/L.结论：用细菌内同源重组法可快速、高效制备表达hSDF1α的高滴度重组腺病毒.为研究hSDF1α在动员骨髓源干细胞迁移到

6、组织损伤部位修复组织损伤的研究奠定了基础.　　【关键词】同源重组；人基质细胞源衍生因子1；腺病毒；基因治疗　　0引言　　　基质细胞源衍生因子1(stromalderivedfactor1,SDF1)属CXC型趋化因子.同基因编码两种蛋白:SDF1α和SDF1β,其受体CXC型趋化因子受体4（CXCchemokinereceptor4,CXCR4）是一个具有7个跨膜结构域的G蛋白耦联的受体［1］.研究发现SDF1α是CD34+造血干细胞的趋化因子,CD34+造血干细胞能沿SDF1浓度梯度向骨髓迁移实现归巢［1-3］.同时,SDF1在骨髓动员中也发挥了重要作用［4-6］.而已知骨髓内除了含有造血

7、干细胞外,至少还含有内皮祖细胞、间充质干细胞.近来研究表明移植的内皮祖细胞、间充质干细胞通过参与或促进血管新生和心肌再生而明显改善了受损心脏的功能.但是国内外关于hSDF1α动员骨髓源内皮祖细胞、间充质干细胞的作用研究很少,尤其hSDF1α在心肌梗死后动员骨髓源间充质干细胞靶向迁移到心梗部位的作用研究更是甚少.因此,为进一步探索hSDF1α在骨髓动员、迁移中的作用,非常有必要制备表达hSDF1α的重组腺病毒.