简化的两步法细菌内同源重组腺病毒表达载体重组高效制备p53基因

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1、简化的两步法细菌内同源重组腺病毒表达载体重组高效制备p53基因邹昌勇，全家妩Δ，田生和，杨京生，吴季南【摘要】目的应用细菌内同源重组高效制备p53基因重组腺病毒。方法设计引物扩增p53基因，在上下游引物分别引入Xhol和HindⅢ酶切位点，将p53基因亚克隆连接到经相同酶切的pshuttle-cmv转移质粒上，转化DH5α筛选卡那霉素抗性菌落构建重组腺病毒转移质粒pshuttle-cmv-p53用Pmel酶切线性化采用两步法进行同源重组：先将腺病毒骨架质料pAdEasy-1转化氯化钙法制备的BJ5183感受态细菌，筛选得

2、到链霉素和氨苄青霉素抗性的AdBJ5183转化菌；再将线性化的pshuttle-cmv-p53转化氯化钙法制备的AdBJ5183感受态细菌，在细菌内进行同源重组，挑选卡那霉素抗性菌落培养并提取质粒，琼脂糖电泳挑选大片断的重组质粒pAdBJ5183-P53分别用限制性内切酶PacI和BstXI及PCR法鉴定。结果成功构建了p53基因重组腺病毒表达载体。结论采用简化的两步氯化钙化学转化法可以取代电穿孔法高效构建重组腺病毒表达载体。【关键词】腺病毒载体；同源重组；p53基因【Abstract】ObjectiveToconstr

3、uctrebinantreplication-defectivehumanadenovirusserotype5vectorcarryingplifiedtologousrebinationprotocolinbacteria.Methodsvandthepositiverebinantpshuttle-p53Ei.Thenthesimplifiedtologousrebinationprotocolployedfortheconstructionofrebinantadenoviralvector.Instepone，

4、adenoviralskeletalplasmidpAdeasy-1edintoBJ5183petentcellsbycalciumchloridechemicalmethedtoobtainpAdBJ5183;andinsteptidedintopAdBJ5183.Thepossiblepositiveadenoviralplasmidsanp53genechloridechemicallysimplifiedtologousrebinationprotocolcanreplacetheco-transformatio

5、nbyelectroperforationandmayhavebroaedutilityinsystemthatinvolvehomologousrebinationinbacteria.复制缺陷型腺病毒可以高效介导基因的体内外转移；感染细胞范围广，不但可以感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞；感染细胞时其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全可靠。因此成为基因治疗中常用的载体。重组腺病毒载体的构建方法有真核细胞内质粒重组法、酵母人工染色体克隆系统、Cre/loxp定点重组系统、末端蛋白-DNA复合物共转染法等［１～３］。以

6、上方法牵涉到的步骤和环节较多、工作量大、实验周期长。1998年He等［4］建立了细菌内质粒共转化同源重组方法，该法简便快速、实验周期短，但是共转化需要电穿孔仪，且同源重组成功率不到20%。笔者在实际工作中对该法进行了改进，采用简化的两步氯化钙化学转化法代替电穿孔共转化法构建了p53重组腺病毒表达载体。1材料与方法1.1实验材料pAdEasy-1、pshuttle-cmv质粒，BJ5183、DH5α大肠杆菌，PmEI酶购自Qbiogene公司；携带p53基因的质粒由马延高教授惠赠；PacI酶购自Neix、DL2000Mar

7、ker购自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker购自Promega公司；其他分子生物学工具酶购自MBI公司。1.2重组转移质粒的构建设计扩增p53基因的上下游引物分别为：p53-up:5atgtctcgagatggaggagccgcagtcaga3（30bp），p53-doin;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30个循环；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收，连接到同样经XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv转移质粒中；转化DH5α感受态菌

8、，卡那霉素抗性平板筛选。1.3重组转移质粒的鉴定挑选卡那霉素抗性平板筛选菌落培养，碱裂解法提取质粒，用XhoI和HindⅢ酶切鉴定，并以能酶切出与目的基因片段大小相符的质粒为模板，用上述引物进行PCR鉴定。得到的重组转移质粒命名为psh-p53。再用上述引物由上海生工公司测定psh-p53中目的基因片段序列。1.4两