腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究

《腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究【摘要】目的探讨凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡的影响，为胆管癌的治疗探索新方法。方法采用含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC939，在确定其感染复数后通过光镜、荧光观察其凋亡情况，同时通过TUNEL染色统计凋亡率。结果胆管癌细胞株QBC939的重组腺病毒的感染复数为65，在感染后第3天凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡，并且随着时间的推移其作用越明显，在第7天凋亡率达到61.9%。结论凋亡素能明显引发人胆管癌细胞的凋亡，在胆管癌的治疗上

2、具有较大潜力。【关键词】凋亡素基因；腺病毒载体；基因治疗；胆管癌【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofadenovirusmediatedapoptingeneonapoptosisofhumanbileductcarcinomacellsandexploreneanagebileductcarcinoma.MethodsThehumanbileductcarcinomacelllineQBC939ultiplicityofinfectioninedsuccessf

3、ully,theapoptosisofhumanbileductcarcinomacelllineQBC939icroscopyandfluorescencemicroscopyandtherateofapoptosisdetectedbyTUNELstain.ResultsThevalueofmultiplicityofinfectionofhumanbileductcarcinomacelllineQBC939transfectedbyrebinantadenovirusanbileductcarc

4、inomacelllineQBC939onthe3rddayandtheinductionfunctionofapoptingeneincreasede.TheapoptosisindexofhumanbileductcarcinomacelllineQBC939reached61.9%onthe7thday.ConclusionTheapoptingenecanobviouslyinducetheapoptosisofhumanbileductcarcinomacelllineQBC939,andma

5、ybeapoa.【Keya凋亡素，又称Apoptin(apoptosisinduction)，是来源于鸡贫血病毒(chickenanemiavirus,CAV)的小分子蛋白质。它能引发一些肿瘤细胞和转化细胞的凋亡，而对正常细胞无此作用。这提示凋亡素在肿瘤的治疗上具有较大潜力［1］。目前胆管癌的治疗效果难尽人意，迫切需要探索新的治疗方法。本实验利用腺病毒为载体转染人胆管癌细胞株，以观察凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的影响程度，以期探索治疗胆管癌的新方法。1材料与方法1.1材料我们已成功构建含凋亡素基因的重组

6、腺病毒载体［2］。不含目的基因的腺病毒载体由第三军医大学西南医院烧伤研究所贺伟峰提供；人胆管癌细胞株QBC939由本研究所王曙光建株［3］；Cytospin3型细胞离心机购自美国Shandon公司；TUNEL试剂购自德国Roche公司。1.2方法1.2.1QBC939细胞的重组腺病毒感染复数(multiplicityofinfection,MOI)的测定：在6孔板上传5×105/孔培养QBC939细胞，细胞过夜生长。将病毒量为6.56×109pfu/ml的病毒稀释5倍后分别取2、5、10、25、50μl

7、(相应的病毒量为：2.61×106、6.56×106、1.31×107、3.28×107、6.56×107)加入6孔板中的5孔，第6孔作为对照。同时加培养液500μl，5%CO2、37℃条件下孵育。间隔30min轻轻摇晃数次，使之与细胞充分接触，孵育3h后加入培养液1500μl，72h后用荧光显微镜观察细胞的荧光情况。选取接近100%的细胞发荧光的孔所对应的病毒量来计算MOI值。公式为MOI=病毒数/细胞数。这样可确定最佳感染复数。1.2.2重组腺病毒对胆管癌细胞株QBC939的感染：根据上一步探索出的

8、最适MOI来决定病毒的量，每日通过荧光显微镜观察并记录QBC939细胞的情况。在1、3、5、7d后分别收集细胞爬片，对于脱落的细胞采用制成细胞甩片来观察。实验共分3组，重组腺病毒组、空病毒组和空白组(培养液组)。甩片的制作为：100×g离心10min，用PBS洗涤细胞1次，然后用4mlPBS重溶细胞，记录收集的细胞数目约为4000个。将1/10的液体加入与甩片装置安装好的玻片上，1000×g离心10min后制成细胞甩片。1.2.3人胆管癌细