养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立-论文.pdf

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1、第35卷第3期渔业科学进展Vo1．35．No．32014年6月PR0GRESSINFISHERYSCIENCESJun．，2014养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立姜娓娓李秋芬刘淮德李晓龙(中国海洋大学海洋生命学院，青岛266003)(农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛266071)摘要利用C,yr8基因的特异性引物建立沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法。将已知浓度的气单胞菌茵液加入灭菌的沉积物样品中，作为模拟沉积物样品。通过选择和优化沉积物DNA提

2、取方法、特异性引物、标准曲线模板，建立沉积环境中气单胞茵属细菌准确检验的实时荧光定量PCR方法，同时验证该方法的特异性、灵敏性、重复性。结果表明，采用改进的溶菌酶．SDS温和裂解法提取沉积物DNA，以扩增培基因片段的IAF和IAR为特异性引物，并直接以模拟沉积物样品DNA为标准品构建标准曲线，可以建立适用于定量检测沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR方法。该方法可灵敏、特异、准确地定量检测刺参养殖池塘底泥中气单胞菌属中不同种的细菌，检出效率可达10CFU／g。统计分析显示，变异系数为0．21％一0．80％，均小于5％，表明重

3、复性良好。关键词GyrB基因；沉积环境；气单胞菌属；实时荧光定量PCR中图分类号Q939．96文献标志码A文章编号1000-7075(2014)03-0126-08Establishmentofthereal·timefluorescentquantitativePCRmethodfordetectingAeromonasinsedimentenvironmentofaquacultureJIANGWei—wei'LIQiu—fenLIUHuai．deLIXiao—long(CollegeofMarineLifeSciences，O

4、ceanUniversityofChina，Qingdao266003)(KeyLaboratoryofSustainableDevelopmentofMarineFisheries，MinistryofAgriculture；YellowSeaFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Qingdao266071)ABSTRACTAeromonasisoneofthepathogenscausingskinulcersyndromeinculturedos—

5、tichopusjaponicas．Itisimportanttomonitorthepopulationofthesebacteriainthecultureenvironmentfordiseasecontro1．Unfortunately．currentreal—timequantitativePCRdetectionmethodiSmostlvbasedonthepurecuhureandcannottrulyreflectthebacteriapopulationinthesedimentenvironment．There

6、fore，weestablishedareal—timefluorescentquantitativePCRmethodtoimprovethepathogende—tection．Thesimulativesedimentsamplesweremadebyaddingknown—concentrationbacteriaintothesterilyzedsediment；theDNAextractionmethodwasselectedbycomparingthreeimprovedDNAex—tractionmethods；ge

7、nus—specificprimerswereselectedbasedontherBgeneofAeromonas．Mean—while，PCRreactionconditionsandsystemswereoptimizedandastandardcurvebased—onextracted国家自然基金项目(31170113)资助通讯作者。E—mail：liqf@ysfri．ae．en收稿日期：2013-07-17；接受日期：2013-08-31作者简介：姜娓娓(1989一)，女，硕士研究生，主要从事环境微生物生态的研究。E-m

8、arl：sdnujiangweiwei@163．COtl第3期姜娓娓等：养殖沉积环境中气单胞菌属细菌的实时荧光定量PCR检测方法的建立sedimentDNAwasutilizedtoexaminethebacteriainthesed