绿豆胰蛋白酶抑制剂精氨酸活性片段衍生物的克隆表达及生物学活性研究-论文.pdf

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1、山西大学学报(自然科学版)36(1)：102～107，2013JournalofShanxiUniversity(Nat．Sci．Ed．)文章编号：0253—2395(2013)Ol一0102—06绿豆胰蛋白酶抑制剂精氨酸活性片段衍生物的克隆表达及生物学活性研究付荣，李宗伟，赵超，单树花，武海丽，袁琳洁，李卓玉(山西大学生物技术研究所，化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006)摘要：绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)具有赖氨酸和精氨酸两个活性中心．通过化学合成MBTI—Argc编码基因，克隆到原核表达载体pGEX一4T—l并转化到大肠杆菌DH5a．表达的可溶性

2、融合蛋白GST—Argc经GST层析柱纯化后体外测定活性表明，该片段3．3分子对1分子胰蛋白酶活力的抑制率不足5．DTNB法定量测定二硫键表明，与天然产物相比，Argc的二硫键个数有所减少．GST—Argc对细胞增殖和迁移生物学效应的检测实验发现，GST—Argc能显著促进细胞的增殖和迁移效应．上述结果表明，MBTI—Argc与天然产物相比在结构和功能上都发生了显著变化，表现出类生长因子活性，可能在组织细胞损伤修复及创伤愈合中具有广泛应用前景．关键词：胰蛋白酶抑制剂；Argc活性片段；二硫键；细胞增殖；细胞迁移中图分类号：Q814文献标志码：A胰蛋白酶抑制剂(trypsin

3、inhibitor，TI)是指具有胰蛋白酶抑制活性的多肽或蛋白质，是一种重要的生化药物和生化试剂[】]．胰蛋白酶抑制剂可以分为两种类型：Bowman—Birk类和Kunitz类．豆科植物Bow—man—Birk类胰蛋白酶抑制剂能够抑制丝氨酸蛋白酶的活性，具促进人类胃肠道健康的作用L2]．创伤愈合是指遭受外力作用，组织出现离断或缺损后的恢复过程，是以细胞增殖、迁移、肉芽组织形成、胶原分泌、组织重建为特点的过程．细胞迁移是创伤修复的第一阶段．近年来，由于氧自由基在缺血性组织损伤的发病中具有重要作用，其介导的细胞损伤得到广泛关注．巯基具有抗氧化作用]，可有效地消除自由基，从而抑制

4、细胞凋亡．绿豆胰蛋白酶抑制剂(MBTI)属于Bowman-Birk类型抑制剂，含有赖氨酸和精氨酸两个活性中心，分别位于Lys—Ser(20—21)和Arg—Ser(47—48)L4]．目前，对MBTI的研究多聚焦在MBTI全长片段或Lys活性片段，而对精氨酸活性片段(MBTI-Arg)研究较少．精氨酸活性片段由27个氨基酸组成，其中包含7个Cys残基，共含有三对二硫键和一个游离巯基．为了进一步了解MBTI—Arg的生物学功能，本文用化学合成方法获得该片段的编码基因，通过原核表达、亲和纯化获得目的蛋白片段．我们将该衍生物命名为Argc．并对Argc的蛋白酶抑制活性和其它生物学

5、活性进行了初步研究．1材料与方法1．1材料1．1．1菌株与质粒E．coliDH5a、质粒pGEX一4T一1均由本室保存．1．1．2细胞株SW480，SW620，MDCK、HepG2、HL7702细胞株购自武汉博士德生物公司．1．1．3酶及主要生化试剂限制性核酸内切酶BamHI、XhoI、T4DNAligase、DNAMarker为TaKaRa公司产品；RPMI一1640、DMEM培养基为Thermo公司产品；ProteinMarker为上海生工生物公司产品；Gtu一收稿日期：2012—05—28；修回日期：2012—06—28基金项目：国家自然科学基金(31040018；3

6、1271516；8115026)；国家大学生创新性实验项目基金(2012B25)；高等学校博士学科点专项科研基金(201I1401110011)作者简介：付荣(1987一)，女，山西太原人，硕士研究生．*通讯联系人：李卓玉(1964一)，女，山西太原人，教授，主要从事蛋白质化学与细胞生物学的研究．E～mail：lzy@SXU．edu．Crl付荣等：绿豆胰蛋白酶抑制剂精氨酸活性片段衍生物的克隆表达及生物学活性研究103tathioneSepharose4FastFlow为GEHealthcare公司产品；BAPA(苯甲酰一dl—Arg—P一硝基酰替苯胺盐酸盐)为上海三杰生物技

7、术有限公司产品；DTNB、MTT为北京索莱宝科技有限公司产品；其他化学试剂均为进口分装或国产分析纯试剂．1．2方法1．2．1MBTI～Argc片段编码基因的合成及重组表达质粒pGEX一4T一卜Argc的构建根据文献E5]报道的MBTI—Arg片段氨基酸序列，委托大连宝生物公司合成Argc片段的编码基因(ON端插入BamHI和XhoI酶切位点)，经BamHI和XhoI双酶切、胶回收目的基因片段，与同样BamHI和XhoI双酶切的pGEX-4T-1载体进行连接，得到重组表达质粒pGEX一4T_1一Argc．双酶切及测序