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1、永川豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其降糖活性研究论文郭瑞华，王和平，刘正猛，翟丽，吴少杰，段姣姣，王宝【关键词】豆豉；,,胰蛋白酶抑制剂；,,分离纯化；,,降糖作用摘要：目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料.freelLobsterSauceProducedinYongchuanandHypoglycemicActionofResearchAbstract：ObjectiveToisolateandpurifythetrypsininhibitorfromLobstersauceandinvestigateitshypo
2、glycemicaction.MethodsAtrypsininhibitorthelobstersauceofYongChuanbydefatting，extractionatographyonSephadexG-75，anditshypoglycemicactioninmiceesoxalylcarbamidemodel，thebloodglucoselevelsodelgroup.ConclusionThetrypsininhibitorhashypoglycemicaction.Keyicaction蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物和微生物中，具有抑制
3、蛋白酶的活性的作用，能与相应的蛋白酶水解，参与体内许多重要生理过程的调节。其中胰蛋白酶抑制剂具有重要的药用价值，对于急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效［1］。蛋白酶抑制剂被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要目的基因来源［2］。大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）与其它临床上广泛应用的胰蛋白酶抑制剂具有相似的性质，但其生理活性研究还没得到足够的重视。和其他胰蛋白酶抑制剂相比，大豆胰蛋白酶抑制剂具有分子量较小、免疫反应较弱、植物来源的抑制剂能避免携带动物病毒、原料来源广、价格低廉等优点，应当得到足够的重视。大豆胰蛋白酶抑制剂的
4、种类有7~10种，目前研究证明主要有两种在动植物体内能抑制胰蛋白酶活力：一种为鲍曼克抑制剂(BBI),是由71个氨基酸组成的多肽，分子量为7975，分子内有7个二硫键，另一个为库尼兹抑制剂（KSTI），分子量约2万，分子内有2个二硫键。近年来国外报道发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑制作用；另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［3］，但未见有降血糖作用的详尽报道。因此，对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制剂，从豆豉中分离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病及其并发症的新药用于临床，有十分积极的意义。
5、1仪器与材料DS1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）,KDC1042离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），AE240电子天平（METTLER公司）；雄性昆明种小鼠（体重18~22g），永川豆豉(市售咸豆豉)，透析袋，牛胰蛋白酶(1∶250)、BAPNAHCl(购自上海维思科贸有限公司),Tris(成都化学试剂厂生产)，sephadexG75(上海化学试剂厂生产)，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖试剂盒GLU（氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司），肝素钠（天津生物化学制药厂），其它试
6、剂均为国产分析纯。2方法与结果2.1豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化2.1.1豆豉胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对热酸环境相对稳定，一般采用水浸酸提、沉淀再经离子交换或凝胶层析纯化制得。取2kg永川豆豉，于46℃恒温干燥9h,干燥后置于干净托盘中,把干燥豆豉粉碎、称重，然后加入去离子水2L，于0℃提取15h。15h后于3000r/min离心6min,.freelin,后用1000ml的分液漏斗分离上述混合液,回收正己烷,收集棕色豆豉提取液。用稀盐酸20%(v/v)调豆豉提取液的
7、pH约为4，于55℃水浴中保温1h。称取固体硫酸铵，分次少量加入于水浴的上清液里，使硫酸铵的饱和度为30%，继续于55℃的水浴恒温15min，离心15min（3800r/min），弃去沉淀，留上清液。在上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为55%，55℃保温10min，再离心15min，弃去沉淀，收集上清液。再于上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度为70%，55℃恒温10min，离心30min（12000r/min），弃去上清液，收集沉淀，用20ml磷酸盐缓冲液（pH7.8）溶解沉淀,沉淀即为抑制剂粗提物［4］，于4℃保存在冰箱里。2.1.2抑制剂
8、粗提物的透析将抑制剂粗提物置于透析袋中蒸馏水充分透析7d，除去盐分
