大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯及降糖活性研究

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1、大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯及降糖活性研究程晓明郭瑞华王和平焦丽艳李扬【摘要】目的研究大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗效果。方法以市售大豆为材料，经酸浸、脱脂、硫酸铵沉淀、透析除盐、葡聚糖凝胶G-75柱纯化等方法进行大豆胰蛋白酶抑制剂的分离提纯。然后，用大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃给药。通过比较正常对照组、实验对照组、大豆抑蛋白酶抑制剂高中低剂量组的多项血液指标（血糖、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇）及各组小鼠病理切片等，研究大豆胰蛋白酶抑制剂的降糖活性。结果给予大豆胰蛋白

2、酶抑制剂灌胃的糖尿病小鼠其血糖水平明显下降，甘油三酯水平下降，总胆固醇水平和高密度脂蛋白胆固醇水平无明显变化。结论大豆胰蛋白酶抑制剂提取物对糖尿病有较显著的疗效。【关键词】大豆胰蛋白酶抑制剂分离提纯糖尿病小鼠胰蛋白酶　抑制剂（soybeantrypsininhibitor,SBTI）是一类可以抑制胰蛋白酶水解活性的小分子多肽，普遍存在于植物的储藏器官，如种子、块根和块茎中〔1〕。大豆胰蛋白酶抑制剂已在多种医药领域有所应用〔2,3〕，另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果〔4〕，但未见SBT

3、I对糖尿病治疗效果的专项研究，本文就大豆胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的治疗作用进行研究和探索。1材料与仪器1.1试剂与药品市售大豆，牛胰蛋白酶(1∶250，上海维编科贸有限公司），BAPNA·HCl(Na-苯甲酰-DL-精氨酸对硝基苯胺盐酸盐，上海维编科贸有限公司)，Tris(三羟甲基氨基甲烷，成都化学试剂厂生产)，SephadexG-75（葡萄糖凝胶G-75，上海化学试剂厂生产），Alloxan（四氧嘧啶，sigma公司），葡萄糖试剂盒-GLU(氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司)，高密度脂蛋白胆固醇试剂

4、盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），甘油三酯试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），总胆固醇试剂盒（酶比色法，通用型，中生北控生物科技股份有限公司），肝素钠（江苏万邦生化医药股份有限公司），硫酸铵，正己烷，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，36%乙酸等均为国产分析纯。1.2仪器DS-1高速组织捣碎机（上海标本模型厂），DF206电热鼓风干燥机（北京医疗设备二厂），FA1004电子天平（科大创新股份有限公司中佳分公司），KDC-1042低速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海

5、精密科学仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海医疗器械五厂），AE240电子天平（METTLER公司）。2方法与结果2.1胰蛋白酶抑制剂的分离纯化2.1.1大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）粗提物的制备用酸抽提法所得粗品蛋白和抑制剂总量高〔1〕，故本实验采用酸性水溶液浸泡大豆粉末提取大豆胰蛋白酶抑制剂〔5,6〕。2.1.2大豆胰蛋白酶抑制剂粗提物的透析除盐将抑制剂粗制备物置于透析袋中蒸馏水充分透析7d，除去盐分。2.1.3凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化〔5,7〕2.2.5SBTI对糖尿病模型小鼠肾脏和肝脏细胞的病理切片显微镜观察结

6、果比较观察图1～3，Control组小鼠肾脏细胞的组织切片中可见，其细胞形态为饱满，结构清晰，与周围细胞的界限较明显，细胞排列相对整齐；肾小球形态正常；近曲小管、远曲小管形状较规则，均匀排列。Alloxan组切片的细胞形态萎缩变形，轮廓不饱满，界限不清晰，细胞排列紊乱；肾小球固缩较明显，肾小球囊壁增厚；肾小管萎缩；间质组织细胞增生明显，有炎细胞浸润。Alloxan+SBTIH组细胞形态、界限、排列状况均较高血糖对照组有改善；肾小球固缩程度减轻；肾小管的形态、排列状况及间质增生情况也有改善。肾组织切片显示，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖

7、尿病模型小鼠的肾组织有一定的保护作用。比较观察图4～6，Control组小鼠肝脏切片中可见，肝小叶结构完整，形态饱满，界限清晰；肝板排列规则整齐，且较为紧密。Alloxan组切片肝脏细胞体积变小；胞质嗜酸性增强，细胞核染色较深；肝板排列较为疏松，且不整齐。高剂量给药组小鼠的肝小叶结构明显，肝板细胞体积增大，排列较整齐、规则。3讨论血糖是糖尿病的主要表征，临床上以血糖值作为糖尿病的主要诊断依据。因此，血糖水平的降低程度可直接反映糖尿病的治疗效果。通过分析各组小鼠血糖水平的实验数据可得出，大豆胰蛋白酶抑制剂对糖尿病具有较好的治疗作

8、用。四氧嘧啶糖尿病小鼠较正常小鼠的血清甘油三酯，胆固醇水平均有升高〔9〕。本实验中，SBTI给药组的血清甘油三酯水平有所降低，其中，SBTI高、中剂量给药组小鼠的甘油三酯水平与Alloxan组之间存在统计学差异（P＜0.01）。另一方面，SBTI对总胆固醇有一定的降低作用，对