单链TRAIL重组表达及生物学活性研究.pdf

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1、单链TRAIL重组表达及生物学活性研究ExpressionandBiologicalCharacterizationsingle-chainTRAIL学科名称：专业名称：研究生：指导老师：培养单位：生物化学与分子生物学许骥．焦炳华教授王梁华副教授第二军医大学基础部二。一一年五月lIIIIIIllllllllIIl＼1909289独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承

2、担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期：知∥’年厂月，．店学位论文版权使用授权声明本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，第二军医大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文全’文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：日期：知∥年歹月导两签名二—岫一‘／J’B瓤：知矿年广ijI，．‘日噬寺厢目录摘要⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5英文缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10正文前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯12第一部分：scTRAIL编码序列的构建和重组蛋白诱导表达与纯化实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32第二部分：scTRAIL生物学活性研究实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯4l实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯46讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50综述TRAIL在抑制肿瘤细胞生长中的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯51参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．57致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61硕士学位论文seTRAIL融合表达及生物学活性研究摘要1995年发现的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)，是肿瘤坏死因子超家族成员之一【l】，属于II型跨膜蛋白。人TRAIL由281

5、aa组成，其编码序列有843bp。C端41～281aa为胞外区，可经半胱氨酸蛋白酶水解为只含有C端114---281aa的可溶性TRAILll抛8l【2】；但在体内并未发现该可溶性分子被酶从膜上切下【3】oTRAIL通过特异性的死亡受体(TRAIL．RI／DR4、TRAIL．R2／DRS)来诱导凋亡【3】【4】。膜结合型TRAIL和TRAILll抛8l在体外均能诱导多种肿瘤细胞的凋亡。TRAIL通过一个Zn2+与3个配体亚单位中第230位的半胱氨酸螯合，形成头尾相接的钟形三聚体，而这种同源三聚体的形式则是TRAIL和受体相结合时，发挥活性的功能模式【51。由于

6、TRAILll¨8l拥有较广的抗瘤谱，且对正常组织细胞几乎无毒性，近年来作为新犁抗肿瘤药物走入临床应用，并已显示出良好的肿瘤杀伤效果。但是，由于体现抗肿瘤活性的TRAIL三．聚体是由三段单体仅仅通过Zn”络合而成，因此结构较为松散，不是很稳定，在使用时易降解而降低抗肿瘤的效果。AnjaKrippner-Heidenreich等成功地将三聚体TNF的三个单体以柔性肽链(GGGS)3或(GGGS)4连接成单链化的TNF(sClNF)。单链化后的scTNF仍然保持原先的三聚体结构，且稳定性增强，毒性减小，抗肿瘤活性略有增强【61。本研究中，我们尝试将人TRAILll

7、抛8I三聚体的三个单体的氨基酸片段以两段柔性氨基酸短臂(GGGS)3，头尾相连，使之融合成为一条多肽链seTRAIL，即：TRAILli抛81．(GGGS)3-TRAILll抛8l-(GGGS)3-TRAILll4．,．281，以增强抗肿瘤的效果。通过PCR和限制性内切酶酶切、连接技术，获得编码单链化蛋白scTRAIL的基因序列，构建了含编码人seTRAIL基因的重组质粒，在宿主菌E．coliBL21中得到了较高水平的表达，并用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱对表达产物进行了初步纯化，获得了融合了麦芽糖结合蛋白标签的可溶性重组蛋白MBP．scTRAIL。最后，对MBP

8、．scTRAIL的生物学活性进行初步研