重组人单链il-23的构建、表达及生物学活性的鉴定

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1、分类号密级学校代码UDC编号学号学位论文重组人单链IL-23的构建、表达及生物学活性的鉴定Constructionandexpressionofrecombinanthumansingle-chainIL-23andidentificationofitsbiologicactivity论文类别：学术研究型作者姓名指导教师姓名申请学位级别硕士学位授予单位学科专业免疫学研究方向抗感染免疫论文答辩时间2012年5月学位授予日期2012年6月答辩委员会主席：论文评阅人：2012年4月目录1．中文摘要………

2、……………………………………………………………12．英文摘要……………………………………………………………………33．论文正文前言…………………………………………………………………………5材料与方法…………………………………………………………………7结果…………………………………………………………………………21讨论…………………………………………………………………………304．结论…………………………………………………………………………335．参考文献…………………………………………………………

3、…………346．附录附录A英中文术语缩略语对照表………………………………………37附录B常用试剂配制…………………………………………………38附录C个人简历及发表论文……………………………………………42附录D综述………………………………………………………………43重组人单链IL-23的构建、表达及其生物学活性的鉴定摘要目的：(1)构建重组人单链IL-23(hscIL-23)融合基因及pMD18-T-hscIL-23质粒；(2)构建原核表达质粒pET28a(+)-hscIL-23和真核表达质粒

4、pcDNA3.1(+)-hscIL-23(3)原核表达hscIL-23重组蛋白；(4)真核表达hscIL-23重组蛋白；(5)初步鉴定真核表达的hscIL-23的生物学活性。方法：(1)设计引物应用重叠延伸PCR技术通过一柔性接头（linker）(Gly4Ser)3串联扩增自本实验室前期构建的pMD18-T-p40质粒和pMD18-T-p19质粒的IL-23p40和p19亚基基因，使p40亚基基因在前，p19亚基基因在后，即p40+linker+p19（简写为hscIL-23）。将hscIL-23

5、融合基因插入至pMD18-T载体中，经基因测序验证融合基因是否正确。(2)提取pMD18-T-hscIL-23质粒DNA，经HindⅢ和NheI双酶切，纯化后的酶切产物hscIL-23基因通过T4连接酶与经和HindⅢ,NheI双酶切并纯化的pcDNA3.1(+)真核表达质粒连接，构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-hscIL-23，采用同样的方法构建原核表达质粒pET28a(+)-hscIL-23。(3)将原核表达质粒pET28a(+)-hscIL-23转化至大肠埃希菌BL21(DE3+)中

6、，IPTG诱导表达带有His标签的重组蛋白，采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白，采用SDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定表达产物。(4)pcDNA3.1(+)-hscIL-23质粒按不同比例通过阳离子聚合物介导转染Hela细胞，同时设转染pcDNA3.1(+)质粒组和未转染质粒组，转染48h后分别收集细胞及细胞培养上清。以人IL-23ELISA试剂盒鉴定各组细胞培养上清中hscIL-23融合蛋白的含量，通过与标准品比对，测定各组细胞培养上清中hscIL-23的表达水平。(5)分离人PBM

7、Cs，加入收集的各组细胞培养上清及PHA-P共培养72h，MTT法本研究受国家自然科学基金项目（编号:30600518/C030112）资助。1检测各组人淋巴细胞的增殖水平。结果：(1)构建的pMD18T-hscIL-23质粒经测序鉴定，插入片段序列序列与预期完全一致。构建的pcDNA3.1(+)hscIL-23和pet28a(+)-hscIL-23表达质粒，其基因测序结果同样无改变，p40、p19、linker的连接顺序、方向及序列均与预期相符。(2)原核表达质粒pet28a(+)-hscIL

8、-23转化的大肠杆菌可成功表达重组蛋白。经SDS-PAGE和Westernblot鉴定，所表达重组融合蛋白（hscIL-23）约为60kd，且能为hscIL-23p19抗体所识别。(3)转染各组质粒的Hela细胞中，ELISA检测Hela细胞在转染质粒48h后培养上清液中hscIL-23蛋白的含量，其中未转染组细胞培养上清为9.11±11.78pg/ml，转染pcDNA3.1(+)组的含量为10.47±9.04pg/ml，而转染pcDNA3.1(+)-pscIL-12组为254.3