重组人scr1真核表达载体的构建、 表达及其生物学活性的论文

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1、重组人sCR1真核表达载体的构建、表达及其生物学活性的论文摘要】目的:采用酵母细胞分泌型载体ppic9k表达人可溶性补体受体（scr1）,研究重组人scr1融合蛋白的体外生物学活性。方法:从人外周血中提取总rna,应用rtpcr获得人scr1全长cdna,然后将其克隆入毕赤酵母细胞分泌型表达载体ppic9k中,构建含人scr1的重组质粒（ppic9kscr1）,经测序鉴定正确,电转化入毕赤酵母细胞smd1168中,将经g418抗性筛选出的重组scr1酵母细胞株进行pcr鉴定,经甲醇诱导,表达产物经sdspage分析和d1

2、168细胞表达出重组scr1融合蛋白。此蛋白在sdspage上表现为mr约31000的蛋白区带,在ab）识别。经ni2+ntaagarose亲和层析纯化后得到较纯的scr1融合蛋白及较高的生物学活性。结论:人scr1融合蛋白在酵母细胞表达系统中的高水平表达,并且有与人体天然蛋白相同的抗原性及其生物学活性。【关键词】可溶性补体受体1毕赤酵母细胞生物学活性真核表达载体补体受体1（plementreceptortypel,cr1）又称c3b/c4b受体,在人白细胞表面被命名为cd35分子,是最早定型的补体受体,也是目前所知最重要

3、的一种补体受体。.an等[1]于1990年首次研制出缺乏跨膜区和胞内区的可溶性补体受体1（solubleplementreceptortypel,scr1）是cr1细胞外片段。并证明了保留天然cr1已知的所有功能单位,但丧失信号转导作用,用于阻断人类疾病对补体不适当激活造成的机体组织损伤,对治疗和诊断补体介导的自身免疫性疾病、病毒感染、肝病、器官移植排斥反应等疾病中具有广阔的应用前景和较高的经济效益。因此,运用基因工程方法构建真核表达scr1,具有一定的研究和应用价值。毕赤酵母菌（pichiapastoris）是一类常用的基因

4、工程及工业表达体系,具有高生物菌体产量、强启动子、高分泌效率、有一定的蛋白质翻译后加工,有利于真核蛋白的表达等优点,便于进行高密度培养和放大发酵规模。目前人们已利用毕赤酵母系统成功表达了许多外源蛋白[2,3]。为了下一步研究scr1用于补体介导的自身免疫性疾病、病毒感染、肝病、器官移植排斥反应等疾病诊断和治疗的可能性,我们从人全血中克隆获得的全长cdna,并在毕赤酵母中进行了表达和生物学活性鉴定。　　1材料和方法　　1.1材料　　巴斯德毕赤酵母细胞smd1168(pep4△his4)、酵母分泌型表达载体ppic9k由福州总医院

5、全军检验中心杨湘越主任技师惠赠;表达于大肠杆菌bl21（de3）中的重组pet28ascr1质粒,dh5α为本室保存;rna全血抽提试剂盒购于qiagen公司;逆转录酶购于promega公司;胶回收试剂盒购自博日科技有限公司;3s柱离心式酵母基因组制备试剂盒购于申能博彩生物科技有限公司;pyrobest高保真dna聚合酶、各种限制性内切酶、t4连接酶、dnamarkerdl2000、1000bpdnaladdermarker、蛋白marker、蛋白预染marker均购自takara公司;引物合成及核苷酸序列均由上海英俊生物技

6、术有限公司和上海生工生物工程技术有限公司测定;溴化乙锭（eb）、生物素、酵母氮碱（ynb）干粉、d山犁醇等均购自上海生工生物技术有限公司;ni2+ntaagarose购自qiagen公司;bca法测定蛋白试剂盒购自pierce公司;g418（氨基糖苷类抗菌素）购于太阳马生物工程有限公司;鼠抗人cd35mab、辣根过氧化物酶（hrp）标记的山羊抗小鼠igg均购于晶美公司;绵羊红细胞溶血素购于浙江省玉环县南方试剂厂;其他所用试剂均为国产或进口分析纯;ypd、bmgy、bmmy和md培养基均按invitrogen公司的毕赤酵母菌实

7、验操作手册配制;pe2400型dna扩增仪为abi公司产品;电转杯、电击仪、transblot电转印仪及fluorstmmultilmager凝胶成像系统均为biorad公司产品。　　1.2方法　　1.2.1重组质粒ppic9kscr1的构建　　（1）扩增scr1基因的引物:5′tctctcgagaaaagagaggctgaagctgccccagatcattttctg3′;下游引物:5′tctgcggccgcctagtgatggtgatggtgatgctcccatttgttcagggc3′。以重组pet28as

8、cr1质粒为模板,用pyrobest高保真dna聚合酶扩增所需克隆的目的片段scr1。（2）pcr扩增条件:94℃变性5min;94℃1min;57℃1min;72℃1min,35个循环,最后72℃延伸10min。pcr产物经加eb的琼脂糖电泳后回收目的条带。（3）重组质粒p