hlab-2705重链的原核表达和活性鉴定

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1、HLAB*2705重链的原核表达和活性鉴定作者：李彦博，孙玉英，郭斯启，孙业平，张秀云，孔繁华，奚永志【摘要】本研究探讨HLAB*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLAB*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEMT载体，序列测定后构建原核融合表达载体pET32a（+）B*2705，并转化大肠杆菌。Tvector.Afteridentificationbysequencing,theprokaryoticexpressingvectorpET32a（+）B*2705orethan50%ofthe

2、totalbacteriaprotein.Theantigenicactivityofexpressedproteinedby（DE3）购自Novagen公司。TagDNA聚合酶、pGEMT载体连接试剂盒和质粒提取试剂盒购自Promega公司，DNA回收试剂盒购自LST公司，小鼠抗人B*2705单克隆抗体购自Serotec公司，碱性磷酸酶标记羊抗小鼠IgG二抗试剂盒及NBT/BCIP显色试剂盒购自华美公司。引物的设计和合成PCR扩增引物：上游5′GAATTCGGCTCCCACTCCATGAGG3′（含NcoI酶切位点）；下游5

3、′GCGCGCCGCTTACCATCTC3′（含NotI酶切位点）。上述引物由上海生工生物工程公司合成。cDNA获得本室保存有HLAB*2705全长cDNA，已经测序鉴定。PCR扩增：95℃预变性10分钟；96℃变性1分钟，55℃退火1分钟，70℃延伸2分钟；共26个循环。DNA回收按试剂盒说明书进行。DNA片段插入T载体参照pGEMT载体连接试剂盒说明书进行。重组子的挑选、酶切和测序鉴定将连接产物转化DH5α感受态菌，以IPTG、Xgal氨苄琼脂糖平板筛选，挑取白色克隆培养过夜，小量提取质粒进行NcoI和NotI双酶切鉴

4、定。鉴定的阳性克隆送TaKaRa公司测序。pET32a（+）B*2705表达载体的构建将测序鉴定正确的克隆，扩增并提取质粒。以NcoI和NotI双酶切并回收DNA片段。pET32a（+）空质粒也同样处理。DNA连接酶连接回收产物。将连接产物转化DH5α感受态菌，以氨苄琼脂糖平板筛选，挑取阳性克隆培养过夜并提取质粒进行NcoI和NotI双酶切鉴定。重组子诱导表达鉴定构建正确的表达载体转化origamiTM（DE3）感受态菌，并以卡那霉素、四环素、氨苄三抗琼脂糖平板筛选，挑选阳性克隆进行IPTG诱导表达。诱导方案：从三抗平板上挑选一克

5、隆接种M9培养基过夜；按1∶100接种三抗M9丰富培养基，37℃摇床>250转/分钟，约3.5小时；至OD600=0.5-0.7时，加入IPTG至终浓度0.5-1mmol/L，37℃摇床震摇5小时，收菌。或者，按1∶100接种后在37℃下培养5小时以上，至OD600=0.8-1.0后，将温度降至22℃，加入IPTG，继续培养过夜，收菌。表达产物的SDSPAGE电泳和：DNAmarker.Lane1:HLAB*2705表达载体的酶切鉴定pET32a(+)/B*2705阳性克隆质粒NcoI/NotI双酶切，获得约960bp的B

6、*2705的插入片段（图2）。上述表达载体是在测序正确后构建的。诱导表达的结果pET32a(+)/B*2705全菌在37℃及22℃诱导表达后，经变性10%SDSPAGE结果分别见图3A和3B。在47kD处可见一诱导表达条带。B*2705胞外区共315个氨基酸，经预测分子量大约为34.7kD，加上融合表达的硫氧还蛋白的分子量12kD，预期分子量大约为46.7kD，这与我们的结果基本吻合。经凝胶扫描软件分析，在37℃及22℃诱导所得的产量分别为53.1%(图3A)和52.4%(图3B)。Figure2.Doublerestrictio

7、nofpET32a(+)B*2705expressionvector.M:DNAmarker.Lane1and2:HLAB*2705.Figure3.SDSPAGEoftotalbacteriaproteininducedforpET32a(+)/B*2705.A:proteininducedat37℃.B:proteininducedat22℃.M:proteinmarker.Lane1:inducedproteinoftotalbacteria.不同诱导条件下B*2705的表达形式诱导表达的全菌经超声碎菌、离心后得到上清和

8、沉淀（包涵体）。将上清与以6mol/L尿素溶液溶解的包涵体经变性10%SDSPAGE。结果显示，在37℃下诱导，B*2705主要出现在包涵体（图4A），而上清中几乎无表达产物；在22℃的低温下诱导，B*2705主要出现在上清（图4B