HLAB-2705重链的原核表达和活性鉴定（医学论文）

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1、HLA少2705重链的原核表达和活性鉴定作者：李彦博，孙玉英，郭斯启，孙业平，张秀云，孔繁华，奚永志【摘要】本研究探讨HLAB*2705重链的原核表达及活性鉴定。从HLAB*2705全长cDNA中PCR扩增出膜外区片段并克隆进入pGEMT载体，序列测定后构建原核融合表达载体pET32a(+)B*2705,并转化大肠杆菌。WesternBlot和阻断抗体反应鉴定它们在体外是否具有HLAB27抗原活性。结果表明：HLAB*2705重链融合蛋白在大肠杆菌中获得高效融合表达，表达产量占细菌总蛋白的50%以上；通过WesternBlot

2、和阻断抗体反应鉴定它们在体外具有HLAE27抗原活性。结论：本研究获得了HLAB*2705重链融合蛋白，为今后的相关研究打下了基础。【关键词】原核表达ProkaryoticExpressionofHLAB*2705HeavyChainandIdentificationforItsActivityAbstractInordertoinvestigatetheexpressionofheavychainofHLAB*2705inprokaryoticsystemandidentifyitsactivity,theextramemb

3、ranegenefragmentofHLAB*2705wasamplifiedfromfulllengthHLAB*2705cDNAbyPCRandclonedintopGEMTvector.Afteridentificationbysequencing,theprokaryoticexpressingvectorpET32a(+)B*2705wasconstructed・TheantigenicactivityofexpressedproteinwasidentifiedbyWesternblotandantibodyblo

4、ckingreaction.TheresultsindicatedthatthefusedHLAB*2705proteinexpressionwithhighefficiencywasobtained・Theexpressedproductwasmorethan50%ofthetotalbacteriaprotein.TheantigenicactivityofexpressedproteinwasconfirmedbyWesternblotandantibodyblockingreaction.Itisconcludedth

5、atHLAB*2705fusionproteinareobtainedasbasisforthefurtherstudies・KeywordsHLAB*2705heavychain;prokaryoticexpression;antigenicactivity强直性脊柱M(ankylosingspondylitis,AS)是致残率较高的脊椎关节病变。脊柱炎症病变从紙骼关节逐渐上升颈椎，晩期致关节变形使患者丧失劳动能力,严重危害生活质量［1］。1973年Brewerton和Schlosstein发现HLAB27和AS之间存在着非

6、常强的关联性［2］。以后的许多研究结果都支持HLAB27与AS之间在遗传学上的联系。首先，HLAB27与AS的关联性在世界上的许多人群中得到重复［3］;其次，B27转基因大鼠和小鼠可产生多系统自发性炎症，与AS非常相似［4,5］o关于HLAE27分子的致病机制有多种假说，例如分子模拟假说［6］和关节源性肽(arthritogenicpeptide)假说［7］等，但证据不足。最近的研究表明，HLAB27存在多种异常形式，如缺乏抗原肽的E27B2微球蛋白复合体、游离B27重链单体、E27重链同源二聚体等［8・10］。这些异常E27

7、可作为自身抗原被CD44-T细胞识别［11］或作为配体被巨噬细胞表达的成对免疫球蛋白样受体(pairedIglikereceptors,PIR)［12］识别而导致AS发病。在本研究中，我们用大肠杆菌高效表达了HLAB27抗原中的一个亚型—HLA审2705重链胞外区，并对其活性进行了初步研究。材料和方法材料大肠杆菌DH5a由本室保存，质粒pET32a(+)和宿主菌origamiTM(DE3)购自Novagen公司。TagDNA聚合酶、pGEMT载体连接试剂盒和质粒提取试剂盒购自Promega公司,DNA回收试剂盒购自LST公司，

8、小鼠抗人审2705单克隆抗体购自Serotec公司,NBT/BCIP显色试剂盒购自华美公司。引物的设计和合成PCR扩增弓［物：上游5’GAATTCGGCTCCCACTCCATGAGG3’（含NeoI酶切位点）；下游5’GCGCGCCGCTTACCATCTC3’（含NotI酶切