链霉亲和毒的原核表达与复性

《链霉亲和毒的原核表达与复性》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、◆唧III!IrPiIIrrlrIrflll＼1838321SA(streptavidin下称SA)是Streptomycesavidinii菌培养过程中外分泌的一种蛋白产物，可以高度特异性地结合水溶性的维生素，D一生物素(D．biotin)。SA．biotin系统具有亲和力高、特异性强、灵敏度高、稳定性好、信号放大等优点，SA．biotin系统广泛地运用于医学、免疫学、分子生物学及组织化学等相关领域。目前SA主要来源于链霉菌属的传统发酵和基因工程菌的外源表达，后者具有生产周期短、产量高、易于纯化等优点，成为近年来生产研究的热点。大肠杆菌表达系

2、统与枯草杆菌表达系统是当前运用最为广泛的两种原核表达系统。前者具有过量表达外源蛋白、生产运用广泛、遗传及分子生物学背景清晰等优点，而后者具有可外分泌表达外源蛋白、安全可靠等优点。本论文运用枯草芽孢杆菌表达系统和大肠杆菌表达系统表达多种形式SA并对表达的蛋白进行复性，目的在于探索获得高产SA的表达菌株以及SA高效复性方案。本研究通过PCR扩增成功获得三种SA的编码基因：sty-13(编码16．133位氨基酸残基)、csa(编码13．139位氨基酸残基)、cnsa(编码13．159位氨基酸残基)。将sty-13克隆到B．subtilis表达载体pP

3、43和pSacR中，构建曰．subtilisWB800(pSacR．sty-13)蔗糖诱导型表达菌、B．subtilisWB800(pP43-stv-13)和B．subtilisl68(pP43-stv-13)组成型表达菌株，但均无明显外分泌表达目的蛋白。将sty-13、csa、cnsa克隆到Ecoli表达载体pET22b、pETlla中，构建成表达菌株BL21(DE3)(pET22b-stv-13)、BL21(DE3)(pET22b—csa)、BL21(DE3)(pETlla-cnsa)、BL21(DE3)pLysS(pET22b-stv-1

4、3)、BL21(DE3)pLysS(pET22b·csa)，BL21(DE3)pLysS(pETlla-cnsa)，ER2566(pET22b-stv-13)，ER2566(pET22b—csa)、ER2566(pET22b．cnsa)，经口TG诱导表达，结果显示BL21(DE3)pLysS(pETlla-cnsa)SA表达量最高。通过表达条件和复性条件的优化，SA表达量占菌体总蛋白的40％以上，其包涵体的复性效率在80％以上。复性后的SA经ELISA鉴定，结果显示其生物活性略低于商品化的标准SA。关键词：链霉亲和素；枯草杆菌表达系统；大肠杆菌

5、表达系统；克隆表达；蛋白复性；ELISA；生物素．链霉亲和素’4r‘hh‘J·p．+～．●AbstractAbstractStreptavidin(SA)isabiotinbindingproteinnaturallyproducedfromStreptomycesavidiniiviasecretionandexceptionallyhighaffinitytowater-solublevitamin，D·biotin．SA—biotinsystemhasadvantageofhighaffinity，sensitivity,specific

6、ity，tabilityandmagnificationforsignal．TheSA-biotinsystemhasbeenwidelyusedformanyapplications，suchasimmunology,medicine，molecularbiology,histochemistry．TheresourceoftheSAiscomefromtheproductionofitsnaturalhostorrecombinantexpressionfromE．coliors．subtillis，Thelastonnetakesadva

7、ntadgeofshrotproductioncycle，highyieldandeasypurification，andthereaserchofrecombinantstreptavidinsisafocusthesedays．TheE．coliands．subtill&expressionsystemarewidelyusedforrecombinantproteinsnow．E．coliandS．subtillissystemexpressionhasadvantageofoverexpression，wideapplicationan

8、dclearbackgroundofgenetics，andthe＆subtillisexpressionsystemhasadvantageofse