链霉亲和素商品化应用简介.doc

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1、链霉亲和素商品化应用简介一、链霉亲和素性质链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomycesavidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。    链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L／mo

2、l。在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。二、亲和素和链霉亲和素的比较相同点1、生物素结合能力：AV：13~15U，SA：14~18U2、活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸：亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点有色氨酸-懒氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。不同点：1、分

3、子量：AV=66KD,SA=54KD2、等电点：AV=10.5,SA=6.0,AV带正电较多，非特异性结合较强。3、位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更适合。4、生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。5、氨基酸序列：AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二硫键。三、链霉亲和素在ELISA中的应用酶联免疫吸附剂测定（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相

4、的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。生物素－链霉亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，1、用于间接包被：可以在固相上先预包被链霉亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过链霉亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗原间接包被。这种包被法主要有以下优点：①增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。②阴性对照、空白对照本底低，检测敏感性高。③用链霉亲和素替代抗体包被微孔，避免了抗体包被微孔时容易发

5、生失活(或不易保存)。①通过生物素将抗体结合于链霉亲和素包被的酶标板上，可克服传统物理吸附方法造成的抗原抗体结合能力大量丧失的不足。②生物素标记捕获抗体、酶标指示抗体和样品中的抗原三者在均相中形成复合物后，再通过生物素结合于链霉亲和素包被的酶标板上，由于链霉亲和素和生物素之间亲和力极强，并且具有高度的特异性和稳定性，因而可提高检测灵敏度。实例：CTnT检测实验中，双抗体夹心ELISA法最低检测值为7.25μg/L，使用链霉亲和素包被法最低检测值达到1.0μg/L，较双抗体夹心ELISA法灵敏度提高7倍。1、用

6、于终反应放大：在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。由于SA的等电点低，表面带的正电荷少，因此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱，SA的阴性对照显色明显比AV低，这样在ELISA上应用SA可进一步提高方法的灵敏度。链霉亲和素对生物素化的抗体是一个主动的吸附过程，生物素化的抗体吸附在链霉亲和素表面，抗体排列整齐，分布均匀，抗体容易保持功能，而被动吸附抗体排列极不规则容易导致大量抗体失去功能，所以将生物素-链霉亲和素免疫反应系统引入竞争法中，可以大大提高酶联

7、免疫的灵敏度和特异性。实例1:地高辛的生物素-链霉亲和素免疫法测定实验中，传统方法被动吸附只有约5％的抗体具有功能，生物素-链霉亲和素体系中60％的抗体具有功能。实例2：淋球菌抗原测定方法实验中，生物素-链霉亲和素法检测灵敏度为0.625μg/L，相当于3.5×104/ml淋球菌，而同时进行常规ELISA测定时，其灵敏度为1.25μg/L。四、链霉亲和素相关商品1、标记化链霉亲和素用酶或荧光素等修饰链霉亲和素，应用于ELISA放大检测信号，提高检测灵敏度。产品实例：①绿色荧光素（FITC）标记Streptav

8、idin蛋白产品说明 荧光素标记抗体（FA）是目前广泛用于免疫病理、细胞化学、流氏细胞学、病理学及自身抗体的临床免疫中的特异、灵敏、定性和定位相结合的免疫化学试剂。荧光素抗体为制备的抗血清，再经过亲和层析纯化的方法制成抗体的IgG成分，并采用直接标记法，将异硫氰酸荧光素共价交联到链霉亲和素分子的氨基基团分子上，经过纯化、蛋白定量、FITC浓度及效价鉴定而制备完成。应用范围：1.免疫组织及免疫病理中抗