生物素－链霉亲和素标记免疫技术.ppt

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1、1第十三章生物素－链霉亲和素标记免疫技术Biotin-AvidinLabellingImmunoassayTech2第一节生物素和亲和素第二节生物素和亲和素标记物的制备第三节生物素和亲和素系统的技术方法第四节技术评价与应用领域3第一节生物素和亲和素生物素（biotin，B）,又称维生素H、B7,动植物中广泛存在，卵黄和肝中含量高；MW244.31D,有两个环状结构；Ⅰ环为咪唑酮环，为与亲和素结合部位；Ⅱ环为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端可与生物大分子连接，形成生物素标记物。Tlymphocyte咪唑酮环噻吩环羧基活化生物

2、素噻吩环上戊酸侧链的羧基经活化修饰后形成的衍生物，只有活化生物素才能偶联各种其他生物大分子，如蛋白质、多糖、荧光素等。4生物素标记蛋白质的特点生物素需活化后才能通过侧链与蛋白质分子连接；多价性-一个蛋白质分子可以被多个生物素标记(放大效应)；抗原、抗体标记后需保持活性不变；多用BNHS标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质，BHZ标记偏酸性蛋白（抗原）可影响标记物活性，如碱性磷酸酶标记后活性会降低；5亲和素（avidin,A）从蛋清中提取的一种碱性糖蛋白，耐热及多种蛋白水解酶作用，每个分子由4条相同亚基组成，每个亚基都可以结合一个生

3、物素分子。与生物素结合的特异性高、稳定性好。K=1015L/mol（BA），K=105～11L/mol（antigen-antibody）但与聚苯乙烯的非特异性吸附较高。6亲和素活性单位以亲和素结合生物素的量来表示；结合1μg生物素所需要的亲合素量为1个亲合素活性单位。一般1mg亲合素约含13～15个活性单位。7链霉亲合素（streptavidin,SA）与亲合素(A)有类似生物学特性的一种蛋白质。由Streptomycesavidinii菌分泌的一种蛋白质，SA分子量为65000，由4条序列相同的肽链构成，每条SA肽链可以

4、结合1个生物素分子。SA与A的ka虽然相同，但在实际应用中其检测灵敏度明显优于A。8A的高pI及高含糖结构导致在聚苯乙烯板和硝酸纤维素膜上或与组织细胞DNA结合时，易产生一定程度的非特异性结合，造成较高的显色背景，而SA较A在应用中明显克服了这一缺点。9亲和素（A）链霉亲合素(SA)结构四亚基四亚基分子量68kD65kDpI106.0氨基酸特点碱性氨基酸较多酸性氨基酸较多糖基化多糖基化无糖基化结合生物素能力44亲和常数（K）10151015活性（U）13～1515～18亲和素和链霉亲合素理化特性比较10第二节生物素和亲和素标

5、记物的制备一、生物素标记物的制备1、作为标记物，活化生物素直接标记大分子生物活性物质如抗原、抗体；根据抗原或抗体分子所带可标记基团的类型（氨基、醛基或巯基）以及分子的等电点2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成新的标记物。3、生物素标记抗体（IgG）的制备基本原理生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽键，从而使其标记上生物素。114、实验流程1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶液；2、用0.1mg/L,pH9.0NaHCO3溶液将纯

6、化的1g抗体稀释为1～2g/L;3、按BNHS：抗体1：8～1：15（体积比）混合，室温搅拌下反应2～4小时；4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2PBS，4℃透析过夜；5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻存备用。12二、亲和素标记物的制备1、几乎所有用于标记的物质均可与亲和素结合，小分子如I125、胶体金、荧光素；大分子如蛋白酶、抗原/体、荧光蛋白等直接标记法：A+E改良过碘酸钠法、戊二醛法间接标记法：A+B+E2、直接标记法（HRP-A/SA）a.改良过碘酸钠法b.戊二醛法戊二醛为一种双功能试剂，通过

7、其醛基分别与酶和亲和素上的氨基共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。15戊二醛分子式3、间接标记法（A/SA-B-HRP）首先将HRP标记上生物素再利用亲和素与生物素间的特异结合能力，合成亲和素-生物素-HRP复合物（ABC）16注意事项：如何除去未标记物？各种成份的比例？17第三节生物素和亲和素系统的技术方法特异性高、亲和力高、稳定性好、多级放大作用；以BAS-酶免疫技术为例一、桥联亲和素－生物素法（bridgedavidin-biotintechnology,BAB法）直接法：生物素标记在一抗上；间接法：生物素标记

8、在二抗上；TlymphocyteBAB法(直接法)检测原理示意图18二、标记亲和素－生物素法（labelledavidin-biotintech,LAB）直接法间接法LAB法(直接法)检测原理示意图20ABC-双抗体夹心ELISA检测原理示意图三、亲和素－生物素化酶复合物法（ABC）PAP