生物素-亲和素反应的放大技术.ppt

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1、生物素-亲合素放大技术第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记一、理化特性二、亲合素（或链酶亲合素）的标记第一节生物素的理化性质与标记一、活化生物素二、活化生物素标记蛋白质第三节生物素-亲合素系统的特点一、灵敏度　二、特异性三、稳定性　四、适用性五、其他思考题小结第四节生物素-亲合素系统的应用一、生物素-亲合素系统基本类型及原理二、生物素-亲合素系统在酶免疫测定中的应用三、生物素-亲合素系统在荧光免疫技术中的应用四、生物素-亲合素系统在放射免疫测定中的应用五、生物素-亲合素系统在分子生物学中的应用生物素（biotin）、亲和素（a

2、vidin）是一对具有高度亲和力的物质，结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。BABBAABC生物素（维生素H）动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高分子量小，244.31DI环为咪唑酮环，可与亲合素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构I咪唑酮环Ⅱ噻吩环羧基:可用于活化为其他衍生物第一节生物素理化性质与标记一、活化生物素生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物－活化生物素(生物素化衍生物)为何要活化？活化生物素活化生物素易与抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物标记蛋白质氨基的活化

3、生物素标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素BNHS分子可与蛋白质赖氨酸（碱性AA）的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质生物素N-羟基丁二酰胺碳二亚胺生物素羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)如何减小空间位阻长臂活化生物素（BCNHS）：生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6-氨基已糖分子基团，形成连结臂，生物素与大分子基团的距离增加，更易发挥生物素的活性作用。生物素分子量小，当与抗体或酶形成生物素标记结合物后，由于大分子蛋白的空间位阻效应，可对生物素与亲和素的结合

4、以及BAS的应用效果造成干扰。？标记蛋白质醛基的活化生物素生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素(BCHZ)：生物素与赖氨酸连接后，再与无水肼反应而成。除醛基外，BCHZ还可标记氨基标记蛋白质巯基的活化生物素马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素标记核酸的活化生物素光生物素(photobiotin)光敏物质侧链上连接的芳香基叠氮物基团,经光照后,变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结合,形成B-核酸探针，用于DNA或RNA的标记。生物素脱氧核苷三磷酸（如Bio-dUTP）作

5、为TTP的结构类似物，可采用缺口移位法（DNaseI和DNA聚合酶I）掺入到双链DNA中。BNHS和BHZ可直接标记核酸，但对碱基配对有影响。目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素。特性：活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性（是BAS多级放大作用的物质基础）；BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质,BHZ则多标记微酸性抗原；抗原、抗体标记后活性不变；可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后，活性降低；二、活化生物素标记蛋白质注意事项：选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类（氨基

6、、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；控制生物素：蛋白质比例生物素：IgG用量比(mg/mg)宜为2:1,IgG应用浓度0.5~5μg/ml;生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；使用交联臂减少空间阻力第二节亲合素、链霉亲合素的理化性质与标记亲合素(avidin,AV)和链霉亲合素(streptavidin,SA)是生物素的天然特异性结合物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链酶亲合素（SA）结合。结构四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI10.56结合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性13～15U15～1

7、8U亲合素（AV）链霉亲合素(SA)一、理化特性SA表面所带正电荷少，且不含糖基，非特异性结合远低于AV，因此目前以SA标记的酶结合物更为常用。二、亲合素/链霉亲合素的标记可标记AV/SA的物质：酶、抗原或抗体、铁蛋白、胶体金、125I、异硫氰酸荧光素（FITC）等。HRP-AV(SA)（酶标记蛋白的直接标记法）：过碘酸钠法、戊二醛法。ABC/SABC：通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。AV(SA)+B-HRP/ALPABC(avidin-biotin-peroxidasecomlplex)/ABAP第三节生物素-亲合素系统

8、(BAS)的特点灵敏度高:生物素标记蛋白具有多价性，且标记后的抗原/抗体生物活性不变，每个亲合素有四个生物素