生物素-亲和素系统相关技术3.ppt

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1、生物素-亲和素放大技术邓念华检验医学院临床免疫学教研室一、生物素-亲和素系统（BAS）一)生物素及活化生物素二)亲和素及链霉亲和素三)生物素-亲和素系统的特点一）生物素及活化生物素(一)生物素1概念：生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。2.分子式：C10H16O3N2S分子量：244.313.结构：（CH2）4COOH咪唑酮环噻吩环结合亲和素结合蛋白质生物素与蛋白质的结合1）生物素分子较小，与蛋白质结合后，由于大分子蛋白质的空间位阻效应，可影响生物素与亲和素间的结合；2）生物素只能依靠肽键与蛋白质上的氨基结

2、合。因此，活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻效应，又可扩大其结合的对象。(二)活化生物素1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。2.标记蛋白质醛基：酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）。3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和BHZ。1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。抗体中性和偏碱性蛋白的标记2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼（BHZ）、肼化生物胞素（BCHZ）用于偏酸性糖蛋

3、白的生物素标记标记对象：大分子活性物质：如抗原、抗体。标记后不影响免疫活性。酶：如HRP、葡萄糖氧化酶和ALP等。会降低ALP的活性。(三)生物素标记蛋白质活化生物素可与不同的大分子物质结合，应根据可标记基团的种类及特性，选择相应的活化生物素；抗体：BNHS偏酸性抗原：BHZ核酸：光生物素一个蛋白质分子可联结多个生物素分子，即生物素化大分子具有多价性，它是BAS多级放大作用的物质基础。但每个蛋白质上标记的生物素分子数量应控制在一定范围。每个抗原标记1-3个生物素分子为宜；每个抗体标记3-5个生物素分子为宜；生物素：IgG(mg/mg)=2:1，效果较好。二）

4、亲和素和链霉亲和素(一)亲和素(avidin，A)1.概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖蛋白。2.分子量：680003.结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它是与生物素结合的基团。A4.特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子可结合4个生物素分子。5.亲和常数：1015/mol6.缺点：由于是碱性蛋白（PI=10），且含糖基，与聚苯乙烯的非特异性吸附较高，会导致本底增大，降低检测灵敏度。二）亲和素和链霉亲和素(二)链霉亲和素(streptavidin，SA)：1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质。

5、2.分子量：650003.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙氨酸含量较大。4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分子。5.亲和常数：1018/mol6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，因此与聚苯乙稀的非特异性吸附远低于亲和素，因此应用广泛。SA标记对象：大分子物质：如酶、抗原和抗体。小分子物质：胶体金、FITC和化学发光物等。二）亲和素和链霉亲和素(三)亲和素的标记三）生物素-亲和素系统的特点1.特异性强：亲和素和生物素间的高亲和力。2.灵敏度高：每个亲和素分子可与四个生物素结合；生物素化大分子具多价性。3.快速、稳定：4.应用广泛：可与

6、酶、荧光素、胶体金等多类标记技术结合；可有Ag与Ab反应的各种免疫方法：夹心法、间接法、竞争法等，在此基础上引入A-B系统。BAB法：BA法：ABC法：二、BAS的基本类型及原理BAB法：Ab·BAAb·B-AB·☼Ab·B-A-B·☼特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E；Ab·B和A-B的两次放大效应，可提高灵敏度。+A+A+BAB法在夹心ELISA中的应用BA法：Ab·BA·☼Ab·B-A·☼特点：省略加标记生物素步骤，操作较BAB法简便；Ab·B的放大效应，该法有相当高的灵敏度。+A-EBA法在间接ELISA中的应用ABC法：⑴A+B·☼A-B·☼-

7、---------ABC⑵Ag+Ab·BAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点：是在BAB法基础上的改良，将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物ABC；操作比BAB法简便，但仍然保持较高的灵敏度。++ABCB-E+AABCABC法在夹心ELISA中的应用1、BAS在酶免疫技术中的应用2、BAS在荧光免疫技术中的应用3、BAS在放射免疫技术中的应用4、BAS在分子生物学中的应用三、生物素-亲和素系统的应用免疫-PCR免疫PCR是在ELISA的基础上建立起来的新方法，用PCR扩增代替ELISA的酶催化底物显色。PCR具有很强的放大能力，其可以定量地

8、检测DNA和RNA，具有非常高的敏感性和特异性，因此