生物素亲和素标记技术完整讲解课件

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1、生物素-亲和素标记技术第一组一背景二原理三实验方法及步骤四应用五反应特点六应用前景一背景生物素：又称维生素H、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为“生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生素。亲和素：亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素

2、分子亲密结合。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。卵白亲合素亲合素链亲合素卵黄亲合素类亲合素等后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已深入研究并得到广泛应用。二原理20世纪60年代初发现了生物素(biontin，B)和卵白素(avidin，A)，其亲和力至少比抗原-抗体结合力高百万倍，是目前发现的自然界中具有最强亲和力的物质。每个分子由4个亚基组成

3、，可以和4个生物素分子亲密结合。亲和素与生物素都可与蛋白质(包括抗原、抗体、酶等)、荧光素等分子结合而不影响后者的生物活性，是理想的标记剂。一个抗体分子可偶联数十个生物素或亲和素分子，而亲和素或生物素分子又可与酶或荧光素结合，从而组成一个生物放大系统，显著提高检测的灵敏度。常用的有亲和素--生物素标记法(Labeledavidinbiotin，LAB)、亲和素-生物素桥法(bridgedavidinbiotin,BAB)和亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法(avidinbiotinperoxidasecomplex，ABC)。生物素-亲合素系统(biotin-avid

4、insystem，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。三实验方法及步骤生物素-亲和素标记技术的主要方法：（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）（3）标记生物素-抗生物素法（L

5、AB法）（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）桥-亲和素-生物素标记法(bridgedavidin-biotintechnique，BAB)分为直接法和间接法，直接法是以游离的亲和素(或链霉亲和素)作为桥联剂，利用亲和素的多价性，将生物素化抗体复合物与标记生物素(如酶标生物素)联结起来，达到检测反应分子的目的。间接法则是在抗原与特异性抗体结合反应后，再用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合，从而使灵敏度进一步提高。由于生物素化抗体分子上连有多个生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲和素-酶标生物素复合物可积聚大量的酶分子。加入相应酶作用底物后，会产生强烈的酶促反

6、应，提高检测灵敏度。SmithKA[5]利用间接BAB法检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，其灵敏度比常规ELISA高1000多倍。酶联免疫吸附试验（ELISA）步骤（间接法）1包被抗原2洗涤3待测血清（抗体）4洗涤5酶标二抗6洗涤7显示物A、B8加终止液(H2SO4)酶标板桥-亲和素-生物素标记（BAB法）步骤间接法步骤：1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法）即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotincomplextechn

7、ology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素-过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素(或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大作用的晶格样网状结