生物素、亲和素标记技术.ppt

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1、生物素、亲和素标记技术广州医学院第一附属医院检验科廖伟娇一、生物素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解特性等电点其它特性1概念:生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布的一种小分子生长因子,又名辅酶R或维生素H。分子式:C10H16O3N2S分子量:244.31结构特点:咪唑酮环/四氢噻吩环结合亲和素侧链末端羧基结合蛋白质溶解特性:难溶于水,易溶于二甲基甲酰胺(DMF)等电点:PH=3.5其它特性:羧基需经活化修饰才能结合蛋白质(羧基活化的生物素,称为活化生物素,也叫生物素衍生物)生物素衍生物的种类及特性:1生物素羟丁酰亚胺酯(BNHS):DMF制备:生物素+N-羟基琥珀酰亚胺

2、二环己基碳二亚胺标记特点:BNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的适用于:标记Ab、酶、中性或偏碱性Ag、DNA长臂活化生物素(BCNHS):DMF+6-氨基己酸制备:生物素+N-羟基琥珀酰亚胺二环己基碳二亚胺(在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸)标记特点:(同BNHS)BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基结合达到标记的目的适用:(同BNHS)标记Ab、酶、中性或偏碱性的Ag、DNA3生物素酰肼(BHZ):制备:生物素+水合肼标记特点:BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记适用:标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA三、亲和素及其理化性质1概念2分子式结构特点溶解

3、特性等电点其它特性1概念:亲和素(avidin):是动物微生物中提取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。链霉亲和素:是从链球菌属的菌培养液中提取的一种蛋白质分子量:A:6.7KDSA:6~6.5KD3结构特点:每分子由四个亚基组成溶解特性:溶于水,C=5mg/ml等电点:A:PH=10.5SA:PH=6.0比活性:A≥12u/mgPSA≥14u/mgP四、亲和素的活性及其测定1亲和素的活性:是表示亲和素结合生物素的能力,即:ugB/mgA或ugB/mgSA。活性测定:⑴羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法:A(SA)+HABA(红色)BA-B(出现黄色时B的量)⑵分光光度法:五、生物

4、素标记物及亲和素标记物的制备:1生物素标记物的制备:B+Ab/Ag/E交联剂B-Ab/Ag/E亲和素标记物的制备:A/SA+Ab/Ag/E交联剂A/SA-Ab/Ag/E六、技术类型:可有Ag与Ab反应的各种免疫方法:夹心法、间接法、竞争法等,在次基础上引入A-B系统。BAB法:Ag+B·AbAg-Ab·BAAg-Ab·B-AB·EAg-Ab·B-A-B·E特点:以游离A分别连接B-Ab和B-E返回BA法:Ag+B·AbAg-Ab·BA·EAg-Ab·B-A-B·E特点:以A-E/SA-E代替BAB法中的A,省却了加B-E的步骤ABC法:⑴A+B·EA-B·E----------ABC

5、⑵Ag+B·AbAg-Ab·BABCAg-Ab·B-ABC特点:将BAB法中的A先与B-E结合,制备成复合物ABC返回+A+AAg-Ab1-Ab2-B+A-EAg-Ab1-Ab2-B-A-E+A-E返回++ABCB-E+AABCAb-Ag-Ab-B+ABCAb-Ag-Ab-B-ABC谢谢

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