临床检验免疫学 生物素-亲和素免疫放大技术

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1、生物素-亲和素免疫放大技术湘雅医学院医学检验系Biotin-AvidinImmuneAmplificationTechnique掌握生物素-亲和素系统的特点﹡目的与要求：熟悉生物素的理化性质与活化了解生物素-亲和素系统的应用概述:生物素、亲和素的发现BiotinandAvidin20世纪60年代初发现了生物素(biotin)和卵白素(avidin)生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白

2、生物素Ⅰ环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要郎部位II环为噻吩环有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，每个亲和素能结合4个分子的生物素亲和素：生物素的及活化标记蛋白质氨基的活化生物素标记蛋白质醛基的活化生物素标记蛋白质巯基的活化生物素标记核酸的活化生物素BNHS（biotinyl-N-hydroxy-succinimideester）:生物素-N-羟基丁二酰亚胺酯BCNHS(N-hydroxy-succinimido-6-biotinyl

3、amidohexanoate):长臂活化生物素标记蛋白质氨基的活化生物素：生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）BNHS的制备方法：*生物素+N-羟基丁二酰亚胺↓BNHS的结构式*长臂活化生物素（BCNHS）生物素与亲和素正常结合大分子造成空间位阻效应长臂生物素克服位阻效应加6-氨基己糖*生物素酰肼（BHZ）：水合肼+生物素*肼化生物胞素（BCHZ）：生物素的羰基+赖氨酸的ε-氨基生物胞素生物胞素+无水肼肼化生物胞素标记蛋白质醛基的活化生物素：因在生物素的羧基上带有肼基，故能标记带醛基的蛋白质标记蛋白质巯基的活化生物素氯化生物胞素+3-

4、（N-马来酰亚胺-丙酰）-N-BNHS↓（DMF）3-(N-马来酰亚胺-丙酰)-生物胞素(MPB)常用于标记核酸分子的活化生物素有：标记核酸的活化生物素：光生物素生物素脱氧核苷三磷酸•基本类型：第二类以亲和素两端分别连接生物素化大分子反应体系和标记生物素，称为BAB法第一类是标记亲和素连接生物化大分子反应体系，称BA法，或标记亲和素生物素法(LAB)。第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗抗体接触时，将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为ABC法生物素-亲和素系统的应用生物素-

5、亲和素系统在ELISA中的应用BAB-ELISABA-ELISAABC-ELISA依据待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体，又分为直接法BAS和间接法BAS。BAB法：也称桥连亲和素-标记生物素法（bridgedavidin-biotintechnique,BRAB）*LAB法：labeledavidin-biotinmethodABCTECHNIQUEavidin-biotin-peroxidasecomplexA:AvidinB:BiotinP:PeroxidaseABCTECHNIQUE直接法的ABC法AgBi

6、otinylatedprimaryantibodyABCTECHNIQUE间接法的ABC法AgPrimaryantibodyBiotinylatedSecondaryantibody生物素-亲和素系统的特点1．高度特异性2．高度灵敏性3．简易、快速、安全、稳定4．应用广泛1、BAS可与多种标记系统如酶、荧光素、铁蛋白、凝集素、SPA、放射性核素等联合用于抗原、抗体、蛋白、激素、受体、核酸系统等多种生物学反应体系2、可作为亲合介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化3、标记生物免疫传感器系统生物素-亲和素系统在分子生物学中的应用主要集

7、中在以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫-PCR(immum-PCR)用于抗原的检测等三方面。四聚体技术四聚体技术是指将MHC单体分子四聚体化，提高其亲和力，可与T细胞上的多个TCR相结合的技术。四聚体（Tetramer）技术www.gotofcm.com抗原特异性CTL的分析方法51Cr释放实验PCR法酶联免疫斑点法(ELISPOT)扩增特异T淋巴细胞受体Tetramer法间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低，费时费力难以广泛应用

8、敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀释法(LDA)用Tetramer法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5%的CD8+细胞对CMV和EBV特异可溶