主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素亲和素放大技术.doc

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1、.....................最新资料整理推荐.....................第十一章生物素-亲和素放大技术第一节　生物素的理化性质与标记 　　生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。 　　生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。 　　生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄

2、和肝组织中提取。 　　一、活化生物素 　　利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。 　　生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。7.....................最新资料整理推荐..................... 　　（一）标记蛋白质氨基的活化生物素 　　此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸

3、的氨基形成肽键。从而使蛋白质标记上生物素。 　　（二）标记蛋白质醛基的活化生物素 　　用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。 　　（三）标记蛋白质巯基的活化生物素 　　3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。 　　（四）标记核酸的活化生物素 　　活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探

4、针。 　　二、生物素标记蛋白质 　　（一）生物素化蛋白质衍生物的特性 　　生物素化蛋白质衍生物有两类： 　　1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。 　　2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。 　　（二）标记方法 　　1.标记抗体、抗原 　　选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。 　　2.标记酶 　　生物素标记辣根过氧化物酶 　　第二节　亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记7.....................最新资料整理推荐..................... 　　亲和素和链霉亲和素是生物亲和

5、素的天然特异性结合物。 　　亲和素或链霉亲和素的结合特性，是建立生物素-亲和素（链霉亲和素）放大技术的重要基础。 　　一、亲和素及其活性 　　耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用，尤其是与生物素结合后，稳定性更好。 　　每个亲和素能结合4个分子的生物素，二者之间的亲和力极强。 　　二、链霉亲和素及其活性 　　链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子。 　　三、亲和素（或链霉亲和素）的标记 　　用于标记亲和素或链霉亲和素的小分子示踪物有125Ⅰ、胶体金、荧光素和化学发光物，大分子物质如酶、抗

6、原或抗体、铁蛋白和荧光蛋白等，其中最常用的是酶、异硫氰酸荧光素（FITC）和胶体金。 　　可以通过与生物素化酶复合物中的生物素结合，间接地与酶形成结合物。7.....................最新资料整理推荐..................... 　　（一）亲和素的标记 　　1.HRP-亲和素结合物的制备。 　　（1）改良过碘酸钠法 　　（2）戊二醛法 　　2.亲和素-生物素化HRP复合物的制备 　　3.亲和素-生物素化碱性磷酸酶（ABAP）复合物的制备 　　（二）链霉亲和素的标记 　　1.HRP-SA结合物的制备采用过碘

7、酸钠法直接标记 　　2.SA-生物素化HRP复合物的制备 　　3.AP-SA结合物的制备采用戊二醛二步法 　　第三节　生物素-亲和素系统的特点 　　一、灵敏性 　　生物素与蛋白质和核酸类等生物大分予结合形戚的生物素衍生物，不仅保持了大分子物质的原有生物活性，而且比活度高，具多价性。 　　二、特异性 　　亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度专一性。因此，BAS的多层次放大作用在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰。 　　三、稳定性7.....................最新资料整理推荐............

8、......... 　　亲和素与生物素间的亲和常数比抗原-抗体反应至少高1万倍，二者结合形成的复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂、蛋白溶解酶以及有机溶剂均不影响其结合。 　　四、适用性 　　生物素和亲和素均可制