贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达.doc

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1、贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达【摘要】目的：实现贵阳腐霉(PythiumguiyangenseSu)类枯草菌素蛋白酶(subtilisin-likeprotease,Pr1)基因在大肠杆菌中的活性表达，验证已获得的基因序列(YP1977)是否属于subtilisin-likeprotease基因家族成员。方法：(1)提取贵阳腐霉总RNA，以已获得的序列(YP1977)为模版设计引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术扩增Pr1基因ORF片段；(2)构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP

2、，转化表达菌株E.coliER2566，IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶。结果：成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP，实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达。结论：证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区。【关键词】灭蚊；枯草杆菌蛋白酶类；逆转录聚合酶链反应；基因，真菌；贵阳腐霉；类枯草菌素蛋白酶；原核表达［Abstract］Objective:ToverifyifaDNAfragmentweobtainedfromPythiumguiyangenseSubeforeistheORF

3、ofasubtilisin-likeprotease(Pr1)ofP.guiyangense,afungalpathogenofmosquitoes.Methods:Aprokaryoticexpressionsystemwasestablished:ThetotalRNAofP.guiyangensewasextractedatthetimepointofmostabundantexpressionofPr1,andcDNAwasobtainedwithreversetranscriptionPCR.Thesubjectsequencewascloned.

4、AplasmidpTWIN1-Pr1-EGFPcontainingthesequenceaswellasanEGFPgenewasconstructed,andtransformedintoER2566cells.ThegeneexpressionwasobservedafterIPTGinduction.Results:GreenfluorescenceproteinexpressedandPr1activityincreasedinER2566cellsafterthetransformation.Conclusions:It'sprovedthatth

5、eDNAfragmentisreallyORFofaPr1geneofP.guiyangense,andthatthemethodforverificationofclonedgeneisefficient.［Keywords］mosguitocontrol;subtilisins;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;genes,fungal;PythiumguiyangenseSu;subtilisin-likeprotease;prokaryoticexpression贵阳腐霉(Pythiumguiya

6、ngenseSu)是由贵阳医学院苏晓庆教授分离得到的一株具有自主知识产权的可以高效地、特异地杀灭蚊幼虫的水生丝状真菌，可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径［1］。通过研究发现，与其它昆虫病原真菌一样，P.5guiyangense菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶（Pr1、Pr2蛋白酶）、几丁质酶和脂酶等水解酶。尤其是Pr1蛋白酶能降解昆虫体壁，在贵阳腐霉侵入孑孓体内过程中应该起重要作用，是贵阳腐霉等昆虫病原菌重要的毒力因子［2］。为了采用基因工程培育贵阳腐霉优良菌株，对该菌的胞外蛋白酶进行研究，并于2004年克隆了一长1519bp的疑是Pr1蛋白酶的DNA片

7、段(YP1977)，为了进行验证，构建了Pr1-EGFP融合基因，再将该融合基因转化大肠杆菌，对其中Pr1蛋白酶的表达进行观察。1材料与方法1.1菌株与质粒贵阳腐霉由贵阳医学院生物防治课题组保存。E.coliER2566、pTWIN1购自NEB公司。1.2YP1977片段的引物合成根据软件预测分析已获得的基因片段YP1977，确定其含有一个可能的ORF阅读框，以此阅读框为模板，使用软件PrimerPremier5.0设计引物SL1(5′-CCGCTCGAGGACCCATTCCGAAAGTCCAAGA-3′)和SL2（5′-CGGGATCCTACAACCGTC

8、CTCCTAACAC-3′），在上游引物SL1的5’