灭蚊真菌贵阳腐霉基因组文库的构建

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1、灭蚊真菌贵阳腐霉基因组文库的构建【摘要】目的：建立贵阳腐霉（PythiumguiyangenseSu）基因组文库以便克隆该真菌的基因特别是与灭蚊毒力有关的基因。方法:用限制性内切酶Sau3AI消化贵阳腐霉基因组DNA，同时用限制性内切酶BamHI消化质粒pBluescriptSK(-)，再将其去磷酸化；将基因组的酶切产物连接到载体上，再转化大肠杆菌DH5α。结果:所建贵阳腐霉的基因组文库共包含11520个克隆。经蓝白斑筛选、PCR验证以及双酶切验证，文库平均插入片段长度为1.2kb，覆盖率约为贵阳腐霉基因组的3倍。结论:建立了贵阳腐霉的基因组文库，可以从中克隆与贵阳腐霉灭

2、蚊毒力有关的基因。【关键词】真菌；灭蚊；DNA限制酶类；贵阳腐霉；基因组文库［Abstract］Objective:ToconstructagenomiclibraryofPythiumguiyangenseSu,strain1938GY.Methods:ThedigestedgenomicDNAidHIandtreatedidsicDNAlibraryentprovideasourceforscreeninggenesofP.guiyangense,andlaybasisforfurtherosquitocontrol;DNArestrictionenzymes;Pyt

3、hiumguiyangenseSu;genomicDNAlibrary贵阳腐霉（PythiumguiyangenseSu）是苏晓庆教授于1994年在贵阳医学院土壤中分离得到的一株新的灭蚊真菌，属卵菌纲、霜霉目、腐霉科、腐霉属。实验证明，几丁质酶在真菌侵染昆虫的过程中发挥着十分重要的作用［1，2］。2003-2005年，对几丁质类似物诱导后的贵阳腐霉悬液中的胞外蛋白酶进行检测，成功地检测到几丁质酶活性，并初步克隆了疑似该酶基因的DNA片段。为了在此片段的基础上获得贵阳腐霉几丁质酶的全长基因以及其他与灭蚊毒力有关的基因，以便用于贵阳腐霉的基因工程改良，因此，构建了贵阳腐霉的基

4、因组文库。现报道如下。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种与质粒真菌：贵阳腐霉（strainGY1938）是1994年在贵阳医学院土壤中分离的高效灭蚊真菌，经纯化接种于SFE和KPYG2琼脂平板上，常规保种、传代，培养温度为（25±1）℃。　　大肠杆菌E.coliDH5α由本实验室保存于-70℃。质粒pBluescriptSK(-)是一种Cloningvector，具有氨苄青霉素抗性,购自上海生工公司。1.1.2试剂限制性内切酶BamHI、Sau3AI、氨苄青霉素（Ampicillin）、T4DNA连接酶为TAKARA公司产品，TaqDNA聚合酶、dNTP、溴化乙锭（EB

5、）为SABC公司产品，RNA酶、牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）、X-gal及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶（IPTG）为Promega公司产品，其余均为进口或国产分析纯试剂。1.1.3培养基KPYG2培养基：蛋白胨1.5g/L,酵母浸出膏0.5g/L,葡萄糖3.0g/L,胆固醇25mg/L,氯化钙110mg/L,玉米油10g/L［3］。SFE培养基：将100g葵花子粉碎，浸泡于1000ml蒸馏水中，6层纱布过滤，再加1000ml蒸馏水，分装贮存于-20℃，临用时取出解冻，用蒸馏水稀释1倍，高压蒸汽灭菌30min［3］。LB培养基：蛋白胨10g/L,酵母浸出膏5g/L,氯化钠

6、10g/L(pH7.0)［4］。基因组文库保存培养基［5］：1/10保存液1（K2HPO4360mol/L、KH2PO4132mol/L、C6H8O7·H2O17mol/L、Glycerol44%）,1/100保存液2(MgSO444mol/L、(NH4)2SO4680mol/L)，50mg/LAmp，液体LB培养基补足100ml。1.2方法1.2.1基因组DNA的提取采用氯化苄法提取贵阳腐霉基因组DNA，将菌丝研磨后加氯化苄等不断混匀，经离心、抽提及RNA酶消化，置-20℃备用。用紫外分光光度计测定基因组DNA浓度，并用琼脂糖凝胶电泳测定其纯度［6］。1.2.2贵阳腐霉

7、基因组DNA的纯化采用北京华美生物公司的DNA纯化试剂盒进行纯化，按其说明书操作步骤进行。1.2.3贵阳腐霉基因组DNA的部分酶切及目的片段的回收用限制性内切酶Sau3AI消化贵阳腐霉基因组DNA产生5’-GATC突出末端，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后-20℃保存备用［7］。1.2.4质粒pBluescriptSK(-)的提取、限制性内切酶酶切和去磷酸化用质粒小量制备试剂盒抽提质粒pBluescriptSK(-)，将其用限制性内切酶BamHI进行消化，产生5’-GATC突出末端，用CIAP使消化后的质粒DNA脱磷酸化，产