基因组DNA 文库的构建.ppt

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1、Loading基因组DNA文库的构建制作：###主讲：###基因组DNA文库与cDNA文库cDNA文库：以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。基因组DNA文库与cDNA文库基因组DNA文库：指将某生物的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的DNA片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应

2、的宿主细胞获得的所有阳性菌落。其实质就是采用“化整为零”策略，将庞大的基因分解成一段段，每段包含一个或几个基因。为什么要构建基因组DNA文库对于高等真核生物，基因数量庞大且复杂，单个目的基因所占比例极其微小，难以直接分离。为增加成功分离的可能性，需要将这个基因进行扩增，但由于分离的是未知基因，故无法进行特异性扩增，只能构建该生物材料的基因文库。构建基因组DNA文库的作用分离有用的目的基因：分离特点的基因片段；分析特点基因结构；研究基因表达调控。保存生物的全部基因：全基因组物理图谱的构建；全基因组序列测定。

3、基因组DNA文库的特点代表性文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。随机性采用机械切割或酶切法随机断裂DNA，保证克隆的随机性。增加文库重组克隆的数目，提高覆盖基因组的倍数。Clark和Carbon于1975年提出如下公式：N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数。p：表示所期望的目的基因在文库中出现的概率。f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组DNA大小的比值。ln(1-p)ln(1-f)N=————————该公式用于预测一个完整

4、基因组文库应该包含的克隆数目。制作基因组DNA文库的常用载体λ噬菌体：最常用到的载体。广泛用于细菌、真菌等基因组较小的物种研究。柯斯质粒：稳定性较差，大量复制易缺失。细菌人工染色体（BAC）：P1源人工染色体（PAC）：酵母人工染色体（YAC）：可以插入大片段DNA，主要用于基因组做图等。基因组DNA文库的制作①工具的准备；②载体的制备；③HMWDNA的提取；④HMWDNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；⑤载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑥重组克隆的挑选和保存；注1：高纯度大分子量基因组DNA(H

5、ighmolecularweightDNA,HMWDNA)。注2：构建噬菌体文库，连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采用包装蛋白进行包装并侵染宿主。注3：以下，以λ噬菌体为例简述DNA文库的制作过程（P184）。①工具准备λ噬菌体载体；限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ；琼脂糖凝胶（或蔗糖）；T4连接酶；注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。②载体的制备cosLRcosBamHⅠ位点载体DNAcosLRcosBB可用载体

6、DNA片段弃去中间片段③HMWDNA的提取④脉冲电泳分级分离真核基因组DNA（约3×109bp）Sau3A做局部消化被限制酶切开的DNA片段SS琼脂糖凝胶电泳纯化约20kb片段⑤体外包装与转化cosLRcosBBSST4连接酶约20kbDN片段体外包装重组噬菌体侵染大肠杆菌大肠杆菌基因文库小结1.DNA文库与cDNA文库的区别2.为什么要构建DNA文库3.基因组DNA文库的作用4.基因组DNA文库的特点5.如何制作一个DNA文库感谢听讲