山羊基因组文库构建

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1、西北农林科技大学硕士学位论文山羊基因组文库构建姓名：唐爽申请学位级别：硕士专业：发育生物学指导教师：张涌20050601山羊基因组文库构建摘要山羊是建立乳腺生物反应器的良好材料。近年来在转基因山羊研究方面取得了一定的进展。西农萨能奶山羊是在原种瑞士萨能奶山羊的基础上，经过五十多年精心选育雨形成的我国优良奶山羊品种，具有个体大，产奶量高，适应性广，抗病性强的优良性状。构建其基因组文库，克隆及应用其优良基因对科学研究和生产都具有极大的价值。本实验应用lambda噬菌体构建了西农萨能奶山羊基因组文库为

2、筛选山羊乳蛋白全基因，构建山羊乳蛋白基因定点整合的转基因敲入载体奠定基础。其结果如下：1、采用Sucrose抽提缓冲液裂解血细胞，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提的方法提取山羊全血DNA，得到了高纯度的DNA。经测定，OD260／OD280=1．81。琼脂糖凝胶电泳显示大部分DNA片段大于100kb。经Sau3AI部分酶切后，分级分离回收15．23kb外源DNA片段。2、将外源DNA片段插入LambdaBlueSTARBamHIArms。在连接反应中，载体与插入片段分子比例为1：3时，得到较好的连接效果

3、。3、重组DNA分子经Lambda噬菌体包装蛋白混合物体外包装为Lambda噬菌体颗粒，Larnbda噬菌体颗粒转染大肠杆菌ERl647，铺于加有x．gal的LB平板上。计算文库滴度。包装效率达到3．4x106pfu／ggDNA。4、将噬菌体颗粒转染大肠杆菌BM25．8，通过菌株表达的Cre重组酶的自剪切作用获得连有基因组插入片段的pBIueSTAR．1质粒。质粒经NotI酶切鉴定插入片段大小。5、本实验共获得1．7x106个有效克隆，插入片断长度在15．23kb范围，成功构建了西农萨能奶山羊基

4、因组文库。关键词：基因组文库，西农萨能奶山羊，lambda噬菌体CONSTRUCTIONOFG}OATGENOMICLIBRARYABSTRACTAcompletegenomiclibraryofXinongsaanengoatwassuccessfullyconstructedusinglambdabacteriophagevectorforscreeningmilk—protein—encodinggeneandconstructionofknock-invector．Theresultsi

5、sasfoUows：1．GoatbloodwaslysisedbysucrosetysisbufferanddigestedbyproteinaseK．GenomicDNApreparedforlibraryconstructionwasextractedbyphenol—chloroform，OD260／OD280=1．81，partiallydigestedwithSau3AI．15—23kbfragraentwasfracfionated．2．InsertsWaSligatedwithLa

6、mbdaBlueSTARBamHIArmsusinginsertwectormolarratios3：1．HighcloningefficiencyWasobtained。3．RecombinantmoleculeswerepackagedinvitrowiththePackageExtract，theninfectedE．coliERl647．Titerofthelibraryis3A×106pfu／；jtgDNA．4．PlosmidDBIueSTAR-insertsubclonesareea

7、silyobtainedbyplatingXBIueSTARphageOnastrmn(BM25．8、expressingcrerecombinaseinthepresenceofcarbenicillin．InsertssizewereidentifiedbyPlasmidNotIdigestion．5．1．7x106clonesWereobtainedwithinsertssizerangingfrom15·23kb．KEYWORDS：genomiclibrary，xinongSaaneng

8、oat，lambdabacteriophage本研究由科技部863高技术研究发展计划：家畜体细胞克隆技术体系的建立和应用(编号：2001AA213081)项目资助Thisworkwassupportedbygrants怕mtheProgramasfollows863ProgramofMinistryofScienceandTechnologyofChina：theEstablishmentandUsageoftheDomisticAnimalNuclearTransferSystem(No200