杜鹃基因组微卫星富集文库的构建

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1、杜鹃基因组微卫星富集文库的构建王书珍，金卫斌，项俊，郑永良，方元平，干建平，程华，杜航（经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室／黄冈师范学院生命科学学院，湖北黄冈　４３８０００）摘要：利用ＦＩＡＳＣＯ方法（ＦａｓｔＩｓｏｌａｔｉｏｎｂｙＡＦＬＰＳｅｑｕｅｎｃｅｓＣＯｎｔａｉｎｉｎｇｒｅｐｅａｔｓ）构建杜鹃（ＲｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎｓｉｍｓｉｉＰｌａｎｃｈ.）的（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库。通过菌液ＰＣＲ检测，从（ＡＧ）ｎ微卫星富集文库的３５６个阳性菌落中筛选了２３３个进行测序分析。结果表明，２０２个序列富含ＳＳＲ位点，阳性比率达８６．７％。去

2、除杂峰、叠峰、信号弱的序列，最终筛选３９个供后续引物开发使用，其中完美型ＳＳＲ有２２个，不完美型５个，混合型１２个。磁珠富集法构建杜鹃基因组微卫星文库是一条高效可行的途径，为微卫星位点的分离、杜鹃种群遗传多样性和遗传结构的研究奠定了基础。.jyqkas等［14］Ｃｈａｒｒｉｅｒ等［１５］用４５４焦磷酸测序技术从Ｒ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｍ基因组内开发了１８个微卫星标记。现有的ＳＳＲ标记难以满足对杜鹃花种群的遗传变异特征、基因流、种群进化历史、遗传图谱构建等研究中对微卫星标记数量的需求。因此，本研究以（ＡＧ）ｎ为探针构建杜鹃花特有种杜鹃（Ｒｈｏｄｏｄ

3、ｅｎｄｒｏｎｓｉｍｓｉｉＰｌａｎｃｈ．）的基因组微卫星富集文库，旨在为杜鹃花群体遗传学分析、遗传图谱构建、花期性状基因的关联分析、ＱＴＬ定位等研究提供高效的ＳＳＲ标记。１材料与方法１．１材料１．１．１材料杜鹃样品取自湖北省麻城市龟峰山山顶“杜鹃花王”的幼嫩叶片。样品采集后置于自封袋内，并放入冰盒中，带回实验室置－８０°Ｃ冰箱备用。１．１．２试剂ＤＮＡ限制性内切酶ＭｓｅＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＮＥＢ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）。ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ均购天根生物公司。链霉亲和素磁珠Ｍ－２８０试剂盒（ＤｙｎａｌｂｅａｄｓＭ－２８０Ｓ

4、ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，１１２－０５Ｄ）、磁珠收集器（ＤｙｎａｌＭＰＣ，１２３－２０Ｄ）购于Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ。克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ购于ＴａＫａＲａ，转化用的大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞由经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。ＡＦＬＰ接头序列Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ－Ａ（５′－ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ－３′）和Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩ－Ｂ（５′－ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ－３′）由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。生物素标记的（ＡＧ）ｎ探针由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ生物公司合成：５′－Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＧ）１３。ＭｓｅＩ－Ｎ混

5、合组由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＮ－３′，Ｎ＝Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ。Ｍ１３通用引物由南京金斯瑞生物公司合成。１．２方法１．２．１基因组ＤＮＡ提取ＤＮＡ提取方法参照改良的ＣＴＡＢ提取法［１６］，并略作修改。提取的“杜鹃花王”基因组ＤＮＡ经０．８％琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计检测后，记录原始结果，并将基因组ＤＮＡ稀释至终浓度为１００ｎｇ／μＬ，－２０℃保存备用。１．２．２微卫星富集文库的构建参照ＦＩＡＳＣＯ（ＦａｓｔＩｓｏｌａｔｉｏｎｂｙＡＦＬＰｏｆＳｅｑｕｅｎｃｅｓＣOｎｔａｉｎｉｎｇｒｅｐｅａｔｓ

6、）方法构建微卫星富集文库［１７］。利用ＭｓｅＩ限制性内切酶对１μｇ的基因组ＤＮＡ进行酶切，酶切成功的标准是出现１００～１０００ｂｐ的弥散带谱；将酶切后的基因组ＤＮＡ片段回收并加ＭｓｅＩ接头（Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩＡ和Ｏｌｉｇｏ－ＭｓｅＩＢ）；利用ＭｓｅＩ－Ｎ引物对连接片段进行预扩增（１２／１４／１６／１８／２０个循环），筛选扩增产物刚刚能在琼脂糖凝胶上呈现的扩增产物（１００~１０００ｂｐ）；将预扩增产物先后与Ｂｉｏｔｉｎ－（ＡＧ）１３探针和链霉亲和素包被的磁珠进行杂交，经过系列非严格洗脱和严格洗脱后回收目的ＤＮＡ片段；对回收的ＤＮＡ片段进行３０个循

7、环的ＰＣＲ扩增，回收２００～８００ｂｐ的片段，与ｐＭＤ１８－Ｔ载体进行ＴＡ克隆并转化到大肠杆菌ＴＯＰ１０感受态细胞内，涂布在含有氨苄霉素的培养基上。１．２．３阳性克隆的测序及分析经氨苄抗性筛选和ＩＰＴＧ诱导后，挑取白色克隆。以Ｍ１３通用引物进行菌液ＰＣＲ检测，扩增产物在１％的琼脂糖凝胶上电泳分析，挑取扩增片段大于５００ｂｐ的克隆交由南京金斯瑞生物科技有限公司测序。以Ｍ１３通用引物进行双向测序，序列比对拼接后用在线软件ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＶｅｃＳｃｒｅｅｎ／）去除载体序列和ＭｓｅＩ接头序列。利

8、用软件ＴＲＦ（Ｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔｆｉｎｄｅｒ，ｖｅｒｓｉｏｎ３．２．１）［１７］查找序列的微卫星位点。按照Ｗｅｂｅｒ［１８］的微卫