基因组DNA测序文库构建

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1、基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3讥样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋口）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无冃的条带则无细菌基因组污染,若出现目的条带则存在污染，需耍去除后建库。2.用Qubit检测DNA样品浓度。3.吸取部分DNA样品,用TE或ElutionBuffer稀释,终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间,体积为130ulo用Covaris破碎，破碎吋请根据需要片段人小，按标准操作流程操作。4.样品足够多的情况

2、下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。MSample驀益1UDW5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul杲丙醇）浓缩凹收，加入50-100ulTE或ElutionBuffer洗脱。回收产物用Qubit测值。6.修平和磷酸化lOOul体系DNAlug5XT4polymerasebuffer20ulBSA(5mg/ml)2ulATP(100mm)luldNTP(10mm)lOulT4DNAPolymerase(5U/ul)lulKlenow(10U/ul)lulT4PNK(10U/ul)1.5ul22°C反应20min,柱式法纯化

3、,50-lOOulTE洗脱。纯化后Qubit测值。1.加'A'lOOul体系0.5~2.5uglOull-3ull-3ulDNA10XklenowbufferdATP(lOmm)Klenow(exon-)(5U/ul)37°反应20min,柱式法纯化,50-100ulTE洗脱。纯化后Qubit测值。&连接头200ul体系10XT4DNAligasebuffer20ulPEG400030ulATP(lOOmm)2ulDNAX接头YT4DNAligase1.5-2ul加水至200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10Z间。9.连接产物川柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割冃的

4、区域回收。10.PCR扩增10XTagEbuffer5ulMg2*4uldNTP(1Omni)lul0.5ullib-PCR-RtagE0.5ulDNASulddH2O33.5ul9.琼脂糖胶回收。10.Qubit测值，总量足够的情况下，取3ul跑胶检测。11.附录T4DNAPolymerase由于同时具有5'-3'DNA聚合酶活性和3'-5'DNA外切酶活性,可以用于将5'端突出末端补平或3'端突出末端削平。T4DNAPolymerase的3'-5'DNA外切酶活性对于单链DNA要比双链DNA活性更高，即单链DNA要比双链DNA中的非配对链部分更容易被T4DNAPol

5、ymerase所消化。T4DNAPolymerase的3'—5'外切酶活性比KlenowFragment要高约200倍。DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)是E.collDNA聚合酶T的蛋白水解产物，具有DNA聚合酶活性和3'-5'核酸外切酶活性，但缺失了5，-3'核酸外切酶活性。Klenow既保留了全酶的高保真性，乂不会降解DNA5'末端。注意：由于该酶具有3'-5'核酸外切酶活性，升高反应温度、加入过量的酶、耒加入dNTP或反应时间过长均会导致DNA末端碱慕被切除形成凹陷。T4多聚核廿酸激酶能够催化磷酸在ATP的Y-位和寡核廿酸链(双链或单链DNA或RNA)的5

6、Z-耗基末端以及3,-单磷酸核井间进行转移和交换，1个Richardson单位，指37C条件下,30分钟内1U催化1nmol酸不溶性［32P］掺入所需要的酶暈。Klenow片段(3'->5'exo-)是大肠杆菌DNA聚合酶T的蛋白水解产物。它保留TDNA聚合酶活性,但失去了5J3'外切核酸酶活性。该酶经突变(D355A,E357A)去除了其3'-5'的外切核酸酶活性(1)。1单位指在37°C条件下，30分钟内能使10nmol的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需要的酶量。注意：Klenow片段(3'f5'exo-)因去除了3'—5'外切酶的活性，故不适宜用于生成平末端的反应

7、。当用于双脱氧法DNA序列测定时(3),建议用1unit/5u1反应体系。