Illumina平台测序原理及常见测序文库构建.ppt

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1、Illumina平台测序原理及常见几种测序文库构建流程简介目录第一部分：测序测序原理与流程简介文库构建(~6hrs)cBotHiSeq2500MiSeqHiSeq2000HiSeq2500GAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace1-8samples1-8samplesDNAIllumina测序流程文库构建(~6hrs)cBotHiSeq25001-8samplesMiSeqHiSeq2000HiSeq25001-8samplesGAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpa

2、ceDNA文库构建流程片段化DNA末端补平3’加A接头连接PCR高质量DNA文库结构文库构建的目的是在目的DNA片段两端都连接上想要的接头此单链部分与FlowCell表面上P7接头相同此单链部分与FlowCell表面上P5接头相同IndexSequencingPrimer文库构建(~6hrs)cBotHiSeq2500MiSeq1-8samplesHiSeq2000HiSeq25001-8samplesGAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace测序芯片(FlowCell)简介flowcell是有2个或

3、8个泳道(Lane)的玻璃片，与一元硬币的厚度相当每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸(oligos,P7和P5接头)在flowcell上进行cluster簇生成仪器简介单条DNA模板约1000条DNA模板的拷贝cBotHiSeqSequenncceerr35个循环的桥式PCRcBot工作流程DNA文库变性：使用NaOH将双链DNA文库变性为单链模板链杂交：将单链DNA模板杂交到FlowCell上第一链合成：以FlowCell表面上的oligos为引物，合成第一链桥式PCR：冲走单链

4、DNA模板，以合成的第一链为模板进行35循环的桥式PCR线性化：将与P5接头连接的DNA链从FlowCell上去除阻断3’–OH：防止在后续测序过程中继续延伸DNA链杂交测序引物DNA模板杂交和一链合成接头序列5’-3’延伸含有P7和P5两种接头的FlowCell表面单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交以杂交的单链DNA为模板，FlowCell上的接头为引物，合成第一链新合成的链原始模板链双链DNA变性丢弃原始模板链模板链被冲洗走新合成的链留在FlowCell上桥式PCR扩增单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交，

5、形成“桥”以接头为引物进行扩增桥式PCR扩增变性变性双链的“桥”得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子第二轮桥式PCR扩增完成桥式PCR扩增完成28循环的桥式PCR线性化双链“桥”变性为单链红色箭头为P5接头上的切割位点线性化切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链阻断阻断3’–OH杂交Read1引物Read1测序引物将测序引物杂交到文库的接头上Illumina测序流程HiSeq2000HiSeq2500GAIIxMiSeqHCS/RTAICSMSRCASAVABaseSpace文库构建(~6hrs)cBotHiSeq25

6、001-8samplesMiSeq1-8samples进行Read1测序杂交Index测序引物，进行Index测序PairedEndTurnround，合成Read1互补链杂交Read2测序引物，进行Read2测序HiSeqSBS测序流程HiSeqSBS测序流程123PairedEndTurnaroundSequencingBySynthesis，SBS测序原理4种Fl-NTP’s+聚合酶拍照，收集信号去阻断，切除荧光基团X36-151可逆终止化学反应一次加入4种修饰的dNTP(可逆终止子)准确度高可以得到同聚物序列合成照相，收集信号

7、去阻断，切除荧光基团下一个碱基合成100MicronsClusters已完成测序合成的片段Blocked3’-ends变性掉已完成测序合成的片段恢复被阻断的3’–OHPairedEndTurnround形成的桥5’-3’延伸桥式PCR5’-3’延伸PairedEndTurnround形成的双链的桥PairedEndTurnround模板链PairedEndTurnround等温变性，完成15轮桥式PCR后，进行线性化，将模板链切除，保留新合成的子链新合成的链3’-OH阻断Read2测序引物PairedEndTurnround线性化，3

8、’-OH阻断杂交Read2测序引物SequencingBySynthesis2ndReadX36-1514种Fl-NTP’s+聚合酶拍照，收集信号去阻断，切除荧光基团Illumina测序流程HCS/RTAICSMSRCA