怎样构建基因组文库.ppt

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1、第四章基因文库的建立基因文库(genelibrary)基因组文库(genomiclibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)第一节基因组文库的构建定义：含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和。一.基因组文库的规模N—基因组文库克隆总数P—所需机率N=f—插入片段与基因组DNA长度之比二．建立基因组文库的一般程序1．载体DNA片段的制备DNA分离纯化限制酶切脱磷酸化反应2．供体DNA片段的制备总DNA分离纯化机械剪切法分离特定大小DNA片段酶法部分酶切分离特定大小DNA片段完全酶切ln（1-P）ln（1-f）3.供体与载体DNA连接要提

2、高重组频率，应注意连接反应体系中的总DNA浓度和两种DNA分子的克分子比率。4.重组DNA分子的转移和基因组文库的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可能发生变化）5.基因组文库质量的评价1）文库规模----随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。2）重组频率----频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。三.利用质粒载体构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。四.利用λ载体构建基因组文库1.载

3、体DNA片段的制备方法:左右臂DNA片段的获得2.供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法3.重组DNA分子的形成：控制克分子比率，使其形成串状DNA分子4.重组DNA分子的包装1）λDNA的包装物的制备使用的大肠杆菌菌株：E.coliBHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包装蛋白E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-头部蛋白i.两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合----本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。ii.两菌株分

4、别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。2）重组λDNA分子的包装过程包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化加入重组λDNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片λ颗粒于-70℃保存待用5.基因组文库的扩增包装的λ颗粒感染E.coli培养分离λ颗粒-70℃保存五.利用COS质粒载体构建基因组文库构建过程与λ载体构建过程相似:两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。为提高文库质量，可采取以下措施：1.双酶切载体产生不同末端以避免其自

5、身形成串状体2.供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排3.载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生载体DNAXhoIorSalI酶切补CT连接重组DNA供体DNASau3AI部分酶切补AG4.采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失利用单COS质粒载体文库利用双COS质粒载体构建基因组文库六.利用P1载体构建基因组文库构建过程也与λ载体构建过程十分相似:1.两臂DNA片段的制备:pAD10sacBBamHI/ScaI2.供体DNA片段的制备:部分酶切蔗糖梯度离心3.两DNA的连接和重组DAN分子的包装1)包装物制备用菌株:E.coli

6、NS3208[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cm-2c1.100am10.1)]:制备pacaseE.coliNS3210[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cmc1.100am131)]:制备头部蛋白2)重组DNA分子的包装与感染与λ重组子包装相似,然后感染E.coliNS3529=E.coliK12recAmcrAΔ(hsdRhsdMmcrBmcrCmrr)(λimm434nin5X1-cre)(λimmλLP1),每微克DNA可

7、在Kanr平板上4X105-2X106Kanr。利用P1载体构建基因组文库七.利用YAC载体构建基因组文库1.两臂DNA片段的制备:pYAC4BamHI/EcoRI脱磷酸化2.供体DNA片段的制备:琼脂糖凝胶-DNA样品的制备EcoRI部分酶切脉冲场凝胶电泳片段回收和纯化3.DNA的连接4.重组DAN分子的转化:原生质体转化法5.转化子的保存:单菌落保存于96孔平板中酵母人工染色体构建第二节cDNA文库的建立定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。一．cDNA文库的特点1.基因特异性

8、常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些