最新怎样构建基因组文库课件ppt.ppt

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1、怎样构建基因组文库基因文库(genelibrary)基因组文库(genomiclibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)第一节基因组文库的构建四.  利用λ载体构建基因组文库1.载体DNA片段的制备方法:左右臂DNA片段的获得2.供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法3.重组DNA分子的形成：控制克分子比率，使其形成串状DNA分子4.重组DNA分子的包装1）λDNA的包装物的制备使用的大肠杆菌菌株：E.coliBHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包装蛋白E.coliBHB2690(N

2、205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-头部蛋白i.   两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合----本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。2）重组λDNA分子的包装过程包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化加入重组λDNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片λ颗粒于-70℃保存待用5.基因组文库的扩增包装的λ颗粒感染E.coli培养分离λ颗粒-70℃保存五.    利用COS质粒载体构建基因组文库构建过程与λ载体构建过

3、程相似:两臂DNA片段的制备，供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包装。单COS质粒载体和双COS质粒载体构建基因组文库。为提高文库质量，可采取以下措施：1. 双酶切载体产生不同末端以避免其自身形成串状体2.供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排3.载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生载体DNAXhoIorSalI酶切补CT连接重组DNA供体DNASau3AI部分酶切补AG4.采用文库快速构建法以避免扩增文库时DNA丢失利用单COS质粒载体文库利用双COS质粒载体构建基因组文库六.利用P1载体构建基因组文库构建过程也

4、与λ载体构建过程十分相似:1.两臂DNA片段的制备:pAD10sacBBamHI/ScaI2. 供体DNA片段的制备:部分酶切蔗糖梯度离心3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装1)  包装物制备用菌株:E.coliNS3208[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cm-2c1.100am10.1)]:制备pacaseE.coliNS3210[=MC1061,suporecD1014hsdR-hsdM+mcrA-mcrB-(P1r-m-cmc1.100am131)]:制备头部蛋白2)重组DNA分子

5、的包装与感染与λ重组子包装相似,然后感染E.coliNS3529=E.coliK12recAmcrAΔ(hsdRhsdMmcrBmcrCmrr)(λimm434nin5X1-cre)(λimmλLP1),每微克DNA可在Kanr平板上4X105-2X106Kanr。利用P1载体构建基因组文库七.利用YAC载体构建基因组文库1.两臂DNA片段的制备:pYAC4BamHI/EcoRI脱磷酸化2.供体DNA片段的制备:琼脂糖凝胶-DNA样品的制备EcoRI部分酶切脉冲场凝胶电泳片段回收和纯化3.DNA的连接4.重组DAN分子的转化:原生质体转化法5.转化子的保存

6、:单菌落保存于96孔平板中酵母人工染色体构建第二节cDNA文库的建立定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部mRNA经反转录成cDNA后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。一．cDNA文库的特点1.基因特异性常来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA2.器官特异性不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所组建的cDNA文库也就不同4.不均匀性在同一个cDNA文库中，不同类型的cDNA分

7、子的数目是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转录而来的。这与基因组文库中的单拷贝基因均具有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。5.各cDNA均可获得表达（一般选用的载体都是表达型的）3.代谢或发育特异性处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同二.cDNA文库的规模N=f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA（mRNA）分子数目之比三.建立cDNA文库的一般程序1.载体DNA片段的制备2.多聚（A）RNA的分离与纯化3.双链cDNA的合成1）单链cDNA的合成：反转录法2）第二条cDNA的合成：碱解或酶解（RNaseH）法

8、除去RNA分子ln(1―p)ln(1―f)2）同聚物加尾：可大大减