基因组文库构建.ppt

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1、第四章基因组文库的构建基因组(genomiclibrary)即基因文库(genebank)是含有某种生物体全部基因的随机片断的重组DNA克隆群体。构建基因文库时先提纯生物的总DNA，通过机械剪切或酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因文库。这群DNA片段含盖基因组全部基因。cDNA文库(cDNAlibrary)：克隆的重组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。这些克隆代表从某个特定物种或器官的所有mRNA制备得到

2、的cDNA。cDNA分子克隆(cDNAclone)：将cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多克隆的过程，最终可建立cDNA文库。建库的目的：1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因；2.是从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。建库的关键：如何产生足够数量的重组DNA建库应注意：1.保证载体DNA和靶DNA均不被外源DNA序列污染；2.尽可能用“电话克隆”。第一节DNA克隆片段的产生与分离一.基因组DNA的片段化1.用限制酶片段化:用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体连接的

3、克隆方法叫鸟枪法(shot-ganapproach)存在的问题：①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在几个重组质粒上，完整筛出更不容易。2.随机片段化：超声波：可产生300bp的短片段。高速搅拌：1500转/分×30分可切平均长度8kb的分子群体。3.双酶消化单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载体容量，如噬菌体插入片段

4、不超过25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp),识别6bp的限制酶切割平均长度4096bp.双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分子量可达10～30kb,它们存在着随机序重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为20kb的随机DNA片段群体。二.DNA片断大小的分部如已知含目的基因克隆片段的大小范围，可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分离。三.目的基因克隆片段的富集。四.克隆数的确

5、定任一DNA序列在文库中出现的概率：N:该序列需要克隆的总数；p:待克隆DNA序列在文库中设定的出现概率，一般为99％；I：待克隆DNA片段的长度，假定为17kb;G:基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp将数据代入上式=8.1×105N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在8.1×105以上时，才能以99％的概率得到此克隆。五.cDNA文库一.概况:cDNA文库是通过反转录mRNA，并制备双链cDNA(doublestrandedcDNA)来构建的。构建cDNA文库的策略

6、是取决于：(1)目的mRNA的相对丰度；(2)筛选方法：除简单的分子杂交法外还可对表达产物用各种方法进行鉴定。cDNA文库的优点(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库；(2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选；(3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。(4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。(5)cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。但应注意：(1)细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。(2)有的基因表达具有严格的时空性

7、，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。(3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。2.制备cDNA文库分离代表细胞中主要mRNA(rRNA和tRNA因其丰富和大小的一致性，可以通过分级直接分离)。mRNA的提取可以通过多胸腺嘧啶的柱子分离。然后被反转录。cDNA第一链的合成用oligo(dT)引物，因为长

8、的mRNA没有被完全反转录,因此中部可加另一引物。第二链cDNA的合成是用自身引物的，一个更有效的方法是在cDNA第一链加尾(如多聚胞嘧啶)，然后用oligo(G)为引物起始第二链的合成。这样产生的双链cDNA可以通过加接头或同聚尾巴插入载体。第二节构建文库的载体一.λ噬菌体载体基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞。载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。重组筛选：插入载体—通过可见标记的插入失