重组人trail及突变体的原核表达和抗肿瘤生物活性研究

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1、中国人民解放军军事医学科学院博士后学位论文重组人TRAIL及突变体的原核表达和抗肿瘤生物活性研究姓名：关良申请学位级别：博士后专业：神经生物学指导教师：刘少君20020301AmDBSABDdmODTTE．coliEDTAhrIPTGkdLBmTRAILamDicilinbovineserumalbuminbasepairdemonizedwaterdithiothreitolEscherichiacoli英文缩略词表ethvlenediaminotetraceticacidnOUrisopropylthio一口一D—galactosidekilodaltonsLuria—Bertanim

2、edium氨苄青霉素牛血清白蛋白碱基对去离子水二硫苏糖醇大肠杆菌乙二胺四乙酸丙基硫代一B—D半乳糖苷千道尔顿Luria—Bertani培养基relatedapoptosis肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配突inducing1igandMTT3一(4，5一dimethylthiazol一2一y1)2，5diphenyltetrazobromideliumODopticaldensityPDBproteindatabase变体四甲基偶氮唑盐光密度蛋白库PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PBSphosphate—bufferedsalinoPCR

3、p01ymerasechainreactionrpmrotateperssecondSDSsodiumdodecylsulfate磷酸盐缓冲液聚合酶链式反应每分转速秒十二烷基硫酸钠Tristris(hydroxymethylo)aminomethane三羟甲基氢基甲烷TRAILtumorrelatedapoptosisinducing1igand肿瘤坏死因子相关凋亡诱2导配体中文摘要肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF—relatedapoptosis—inducing1igand，TRAIL，也称为Apo一2L)是wiley1995年首次克隆成功的～种新的抗肿瘤细胞因子，属于TNF家族的

4、一个成员，在人体的多种组织中如脾、肺、前列腺、胸腺和外周血淋巴细胞等正常组织均可发现其表达。人TRAIL蛋白编码281个氨基酸，它的基因位于染色体3q26。TRAIL与目前发现的TNF家族的其它主要成员，如TNF_a，TNF—B(也称为淋巴毒素或LT—n)，淋巴毒素一B(LT—B)，4lBBL，OX40L，CD27L，CD30L，CD40L和FasL(CD95L，也称为Apo—lL)等配体均为II型膜蛋白，可水解形成可溶性同源三聚体，参与调节机体内的许多重要生物功能。TRAIL除了在免疫调节和炎性反应方面起重要的作用外，还与TNF家族中的TNF—a、TNF—B、FasL配体可导致易感细胞凋

5、亡。TRAIL与这些配体的区别在于，除可特异性导致肿瘤细胞发生凋亡外，不损伤正常细胞。这些细胞因子的跨膜受体含有死亡结构闽，与配体结合导致引起凋亡的一系列蛋白酶反应。本研究首先对合成的TRAIL寡核苷酸全长进行了诱导表达和纯化，获得了有活性的TRAIL蛋白，并验证其抗肿瘤效应。同时采用分子模建方法，对TRAIL结构进行了缺失突变，得到了两个突变体，并对它们进行了热诱导表达，以便深入的研究结构与功能的关系，为TRAIL开发成新的抗肿瘤药物打下基础。1．人TRAIL寡核苷酸全长合成及在大肠杆菌中表达和纯化人TRAIL寡核甘酸全长843个碱基，我们对其分段合成，然后进行全长拼接，并改变其中的30

6、个密码子，以纠正氨基酸偏性，更利于在原核载体中进行表达。核苷酸自动测序结果，与预想的序列一致。合成的产物亚克隆至pGEx一2T质粒构成TRAIL—pGEX一2T，然后转染受体菌DH一5d大肠杆菌。我们在低温30℃，用IPTGO．4mM／L诱导TRAIL融合蛋白表达，得到了TRAIL融合蛋白。然后采用亲和层析方法纯化TRAIL蛋白。2．TRAIL的抗肿瘤生物活性用A172人胶质细胞瘤，B104神经母细胞瘤，SKNsH人神经母细胞瘤，辜事医学科学院博士最研究擐告BGc823胃腺癌，A549肺腺癌，H69小细胞肺癌，KB鼻咽癌等细胞株为效应靶细胞，加入重组的TRAIL蛋白，发现终浓度1肛g／ml

7、TRAIL可明显导致这些肿瘤细胞发生凋亡。3．计算机辅助设计TRAIL突变体TRA¨．可溶性分子(sTRAIL)由膜外区的95—281位残基组成。我们采用分子模建方法，根据TRAIL分子与其受体作用的复合物模型，借助计算机图形学技术，距离几何学及复合物空间构象对配基TRAIL与其受体作用模式进行三维空间展示分析，从理论上对配基TRAIL进行缺失突变，在突变过程中，使突变体保持其原有结合受体的生物学功能。经过模建，得到了两