环孢霉素A体外对白血病细胞作用的的研究3.pdf

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1、·232·中国实验血液学杂志JournalofExperimentalHematology2001;9(3)3环孢霉素A体外对白血病细胞作用的的研究乔建辉　　艾辉胜　　刘广贤　　张　婧　　周　莉(军事医学科学院附属医院血液科　　北京　100039)摘要　　为了进一步探讨环胞霉素A(CSA)逆转白血病细胞耐药的机理,采用溴化四氮唑兰法(MTT)测定K562和K562/ADM白血病细胞系对化疗的体外反应性,以脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)及琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,台盼蓝拒染法测细胞存活率。结果发现CSA在1.0mg/L水平对两种白血病细胞存活无明显影响,但能够增强其对

2、化疗药物的敏感性,促进化疗药物诱导的白血病细胞凋亡,当浓度大于1.0mg/L时单独CSA也能杀伤白血病细胞并诱导其凋亡。结论提示,CSA可以通过促进细胞凋亡逆转白血病细胞的耐药,其自身也有一定的诱导白血病细胞凋亡及杀伤白血病细胞的作用。关键词　　环胞霉素A　　白血病细胞　　K562细胞　　耐药性　　细胞凋亡中国图书资料分类法分类号　　R733.7R979.1[1,2]　　研究表明,耐药性是导致急性白血病病人前停止加药1-2周。化疗失败及缓解后复发的主要原因之一。体内外使体外药敏试验(MTT法)用环胞霉素A(CSA)和异博定等逆转剂可部分地逆以对数生长期的K562或K562/ADM细胞2×转白

3、血病细胞的耐药性。CSA是目前临床应用最5410/ml(0.4×10/孔)接种于96孔板,分别加入6多且疗效较好的耐药逆转剂之一,但迄今为止CSA个浓度梯度的ADM或CSA药物(浓度为0.032,的耐药逆转机理尚不十分清楚,比较一致的观点是0.16,0.8,4.0,20.0,100.0mg/L),培养3天后,CSA可结合细胞膜上的P糖蛋白(PGP),从而使细加入MTT20μl,培养8-12小时,加入DMSO100胞内药物浓度增加而逆转耐药。但实际上,单纯细μl,待完全溶解后用酶标仪测570nm波长的OD胞内药物浓度增加并不能完全解释CSA的逆转作值,用LIGAND软件计算IC50及存活曲线。

4、用。本研究从细胞凋亡及药敏性的角度进一步观察细胞凋亡测定了CSA在体外对白血病细胞的作用。TUNEL法　取1×106的细胞用PBS洗3次,取50μl在LTB2T离心涂片机上涂片,晾干,用铝箔材料与方法包好,冻存于-20℃条件下备用。用时取出晾干,用4%多聚甲醛室温固定30分钟;PBS洗片,0.3%药物与试剂H2O2室温30分钟;PBS洗片,0.1%TritonX2100CSA(诺华公司),阿霉素(ADM,日本明治株式冰上放置2分钟;PBS洗片,20μlTUNEL反应混会社),溴化四氮唑蓝(MTT,Fluka公司),TUNEL合物湿盒37℃60分钟(阳性对照则在此前加用法细胞凋亡试剂盒(Boe

5、hringerMannheim公司),DNaseI1mg/ml20μl室温10分钟,阴性对照则换RPMI1640培养基(Gibco2BRL公司)。作LabelSolution15μl);PBS洗片,20μlConverter2细胞培养POD湿盒37℃30分钟;PBS洗片×3,50μlDAB底K562细胞是人慢性髓性白血病红白血病变的[3]物溶液室温10分钟;PBS洗片,苏木素复染,封片镜细胞系,K562/ADM细胞(中国医学科学院天津检。计数100个细胞,计算阳性率。血液学研究所提供)是由K562细胞诱导的多药耐7DNA梯带测定　收集1×10个细胞,提取药细胞系。两种细胞均培养于含10%胎牛

6、血清的RPMI1640培养液中,每2-3天传代1次,其中3全军九五科研基金资助课题　编号9612025K562/ADM常规培养于1μg/ml的ADM中,试验2000-06-15收稿;2001-04-01接受©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.环孢霉素A体外对白血病细胞作用的的研究·233·[4]DNA,琼脂糖凝胶电泳后紫外灯下照相。ADM不同,当CSA<1.0mg/L时,其与ADM合用活细胞检测(台盼蓝拒染法)对于K562细胞的杀伤作用与ADM单独作用无明0.4%台盼蓝20μl与细胞悬液20μl1∶1混

7、合,显差别;当CSA≥1.0mg/L时,则两药联合作用逐3分钟后计数200个细胞,不着色者为活细胞,计算渐增强,其中CSA1.0mg/L与ADM合用对K562其百分比。细胞的IC50由0.0983mg/L变为0.0305mg/L。此结果说明两者合用对K562/ADM作用更强(图2)。结　　果单独CSA对白血病细胞的杀伤作用两种白血病细胞系合1例初治白血病及1例难治性白血病病人的原代细胞,即共4种白血病细胞,它