PI103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究

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1、PI-103对多药耐药白血病细胞体外作用的研究【摘要】目的研究PI-103对耐药白血病细胞的效果及其机制。方法四甲基偶氮唑蓝（MTT）法研究PI-103对K562及K562/A02细胞增殖的影响，流式细胞术研究细胞内阿霉素浓度的改变。结果PI-103能显著抑制两种细胞株的生长，对敏感和耐药白血病细胞株具有相同的抑制效果；PI-103能显著增加细胞内阿霉素的浓度，与阿霉素联用时，能增加阿霉素对细胞的生长抑制作用，但仅有叠加效应而无协同效应。结论PI-103对于耐药白血病是一种有良好应用前景的药物。【关键词】白血病多药耐药PI-103多药耐药是急性白血

2、病治疗失败的主要原因，其主要机制是P-糖蛋白（Pgp）高表达，将细胞内的化疗药物“泵”出细胞外，导致细胞内药物浓度过低，使白血病细胞呈现出耐药表型。如何绕过Pgp的泵作用，逆转耐药，提高白血病的治疗效果是当前治疗的重要方向。K562/A02是由K562细胞经长期阿霉素诱导和克隆筛选而建立的一个耐药细胞系[1]，能在2μg/ml阿霉素中长期生存，对阿霉素的耐药指数在10以上。它高表达Pgp，是体外研究多药耐药的一个较好的细胞模型。7PI-103是一种人工合成的PI3K和mTOR特异性抑制剂。PI3K和mTOR是PI3K/AKT/mTOR信号转导途径的

3、重要成员，该信号途径在肿瘤的发生发展中发挥着重要的作用。近年来发现PI-103对黑色素瘤[2]、肺癌[3]、神经肿瘤[4]等多种肿瘤具有抑制作用，显示了较好的抗肿瘤效果。本研究旨在研究它对多药耐药白血病细胞株K562/A02的作用。1材料和方法1.1细胞株及培养条件K562及K562/A02细胞株由浙江大学医学院第一附属医院血液病研究所传代保存。培养基为含10%胎牛血清的RPMI1640（Gibco公司产品），置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，K562/A02长期以2μg/ml阿霉素（ADM）加压培养，在实验前2周撤除阿霉素。取对数生长期

4、的细胞进行实验。PI-103购自美国cayman公司。1.2MTT法测定细胞增殖：取对数生长期细胞，调整细胞浓度，以1×105个细胞/ml的终浓度接种于96孔培养板，加入不同浓度药物，空白对照组以培养基补足，每孔总体系0.2ml，CO2孵箱内培养24小时（h），加MTT工作液20μl/孔（美国Sigma公司），置CO2培养箱中孵育4h，1000rpm/min离心，小心吸去上清，加入二甲基亚砜0.2ml/孔，吹打，使紫蓝色甲臜沉淀充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度值（A）。以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线。实验重复三次，设复孔三个

5、，取平均值为最终结果。按下列公式计算细胞增殖率：细胞生存率=（A处理组-A空白组）/（A对照组-A空白组）*100%细胞生长抑制率=1-细胞生存率1.3流式细胞术测定细胞内阿霉素浓度：将0.2μM的PI-103和/或2μg/ml阿霉素与终浓度为1×7105/ml的细胞共同孵育24小时，收集1～5×105个细胞，1000rpm离心5min，弃上清。加入适量冷PBS，细胞重悬，1000rpm离心5min，重复2次。以冷PBS重悬细胞，上机行流式细胞检测。流式检测激发波长488nm，接收波长575nm。细胞内阿霉素浓度高低以荧光强度为计量单位。1.4统计

6、学处理采用t检验，所有数据经SPSS11.5统计软件分析。2结果2.1PI-103对敏感和耐药细胞株的生长抑制作用相同我们用MTT法检测了不同浓度PI-103对K562及K562/A02细胞增殖的抑制作用。0.5-5μM的PI-103处理24h后，两种细胞均呈现出明显的细胞生长受抑。而且，细胞的生长抑制呈现出剂量依赖性。此外，在相同浓度的PI-103作用下，两种细胞株的生长抑制率基本相同，差异无统计学意义（P>0.05)。2.2PI-103能增加白血病细胞株对阿霉素的敏感性，但仅有叠加作用为进一步了解PI-103与阿霉素是否具有协同抑制白血病

7、细胞增殖作用，我们用0.2μMPI-103与不同浓度阿霉素联合作用于K562细胞及K562/A02细胞，以MTT法观察了药物联用对两细胞的生长抑制效果。结果显示，0.2μ7MPI-103对K562及K562/A02细胞的抑制率分别为10.5%和16.4%，加用PI-103后，阿霉素对K562细胞的抑制率有所增加，但单用阿霉素组的生长抑制曲线与联用PI-103组的生长抑制曲线几乎平行，说明PI-103联用阿霉素仅有叠加作用，而无协调作用。同样，在K562/A02组，但单用阿霉素组的生长抑制曲线与联用PI-103组的生长抑制曲线几乎平行。说明PI-10

8、3联用阿霉素对K562/A02细胞生长抑制作用也仅有叠加作用，而无协同作用。2.3PI-103能增加耐药细胞株细胞内阿霉素