ca2+对人肝癌多药耐药细胞pkc的诱导作用

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1、湖北中医药大学硕士学位论文Ca2+对人肝癌多药耐药细胞PKC的诱导作用姓名：邓薇申请学位级别：硕士专业：药理学指导教师：汪选斌20120517中文摘要目的：肝癌是临床常见的恶性肿瘤之一。肝癌细胞的多药耐药(MDR)是肝癌化疗失败的主要原因之一。现有研究已经证实P—gp是MDR产生的机制之一，且MDR的产生总是伴随着PKC活性或含量的改变。PKCot与P．gP蛋白的表达有关。本课题为了研究在人肝细胞肝癌(HCC)中PKCa是否需要Ca2+激活，同时阐明Ca2+对人肝癌多药耐药细胞PKCa的诱导作用。方法：1．实验分组：将人肝癌细胞BEL．7402和人肝癌多药耐药细胞BEL一7402／ADM

2、分为8组，分别为BEL．7402、BEL．7402+TMP、BEL-7402+VRP、BEL．7402+IP3、BEL．7402几蛐M、BEL．7402／ADM+聊、BEL-7402几∞M+VRP、BEL．7402几∞M+IP3，用于激光共聚焦实验；其它实验则分为lO组：BEL．7402、BEL．7402+TMP、BEL．7402+VRP、BEL．7402+肿+IP3、BEL．7402+Ⅵ冲+IP3、BEL．7402几∞M、BEL．7402几∞M+TⅣm、BEL．7402／ADM+VRP、BEL．7402／ADM+TMP+IP3和BEL．7402／ADM+VRP+IP3。2．实验方法：2

3、．1测定人肝癌多药耐药细胞内钙离子的变化情况：采用激光共聚焦显微镜测定用三磷酸肌醇(IP3)、维拉帕米(Ⅵ冲)和川芎嗪(TMP)分别作用人肝癌细胞以及人肝癌多药耐药细胞后细胞内Caz+的平均荧光强度。2．2测定钙离子对人肝癌多药耐药细胞PKCot的影响：采用MTT测定用7个浓度梯度的ADM作用10组细胞，计算每组细胞的IC50；采用免疫荧光实验检测10组细胞中PKCa的荧光强度变化；用8000nmol／L的阿霉素分别作用lO组细胞，采用荧光显微镜检测10组细胞内ADM的红色荧光强度的变化；采用流式细胞仪(FCM)检测lO组细胞内发出ADM红色荧光的细胞占细胞总数的百分比；用高效液相色谱法

4、(mLC)检测10组细胞内ADM的浓度。结果：(1)激光共聚焦结果显示：空白的BEL．7402细胞及BEL．7402／ADM细胞内的Ca2+平均荧光强度分别为：574．08±3．30和665．16+_2．89，两者比较P<0．05，有显著差异；BEL．7402+IP3、BEL．7402+TMP及BEL．7402+VRP的胞内钙浓度分别为：777．78+6．35、479．17+_5．83和478．26+4．08，而BEL．7402／ADM+IP3、BEL．7402／ADM+TMP及BEL．7402／ADM+VRP则分别为：800．00+8．45、541．67+8．15和522．73+7．2

5、3，以上耐药组与亲本组比较，药物干预组与亲本组比较，P<0．05，具有显著性差异；(2)MTT结果显示10组细胞的IC50分别为：BEL．7402组为56．68+0．21；BEL．7402+TMP组的为28．58+0．43同空白对照组比较P<0．05；BEL．7402+VRP组的为37．954．0．29；BEL．7402+TMP+IP3组为29．52-40．37；BEL．7402+VRP+IP3组为41．35：t：0．52；BEL．7402／ADM组为74．03士0．30；BEL．7402／ADM+TMP组为48．38+0．18；BEL．7402／ADM+VRP组为51．62-40．34

6、；BEL．7402／ADM+TMP+IP3组为48．04+0．13；BEL．7402／ADM+、佩P+IP3组为56．064-0．12，以上耐药组与亲本组比较，药物干预组与未用药物干预组比较，P

7、度明显增强；5组耐药细胞组内荧光强度趋势同5组亲本细胞组内趋势；用相同方法处理的耐药组细胞同亲本组细胞相比，前者的PKCa荧光强度明显增强；(4)荧光显微结果显示：BEL．7402+TMP组和BEL一7402+VRP组同BEL．7402组比较细胞内的阿霉素的荧光强度明显增强；而BEL．7402+TMP+IP3组和BEL一7402+VRP+IP3组分别同BEL．7402+耵衄组和BEL．7402+VRP组比较，细胞内阿霉素的荧光强度明