egr-1调控低氧诱导的细胞自噬对肝癌化疗耐药的作用及其机制

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1、@江篇犬爹硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题0:Egr-l调控低氧诱导的細胞自噬对肝癌化疗耐药的作用及其机制学科专业：生理学作者姓名：熊ニ梦导师：袭爱华副教授指导教师：彭琬昕讲师答辩日期：ニO—三年六月硕士学位论文Egr-1调控低氧诱导的細胞自噬对肝癌化疗耐药的作用及其机制Egr-lRegulatesHypoxia-inducedAutophagyinChemo-resistanceofhepatocellularCarcinomaCells作者姓名：熊ニ梦导师：龚爱华副教授指导教师：彭琬昕讲师申请学位：硕士学科

2、专业：生理学（肿瘤细胞生物学)论文提交日期：2013年4月27日论文答辩日期：2013年06月09日学位授予单位：江苏大学答辩委员会主席：陈永昌教授基金资助：国家自然科学基金();江苏大学高级人才科研启动基金(10JDG045)学位论文版权使用授权书江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致，允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国学位论文全文数

3、据库》井向社会提供查询，授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本论文編入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》井向社会提供查询。论文的公布（包括刊登）授权江苏大学研究生院办理。保密口本学位论文属于不保密0江苏大学硕士学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。曰期:年。月/f曰江苏大学硕士学位

4、论文摘要目的：1、通过体外模拟低氧微环境，探讨Egr-1在低氧诱导的肝癌細胞化疗抵抗中的调控作用。2、探明肝癌細胞在低氧条件下Egr-1通过调控细胞自噬促进肝癌細胞化疗抵抗的分子机制，为应用该基因提高肝癌化疗效果提供理论基础。方法：1、MTT法检测肝癌HepG2和SMMC-7721细胞在常、低氧条件下对不同浓度化疗药（顺铂和多柔比星）的敏感性差別。2、在肝癌细胞中采用腺病毒DNEgr-1竞争性抑制Egr-1的作用，用MTT法检测肝癌細胞中Egr-1对低氧条件诱导的化疗抵抗的影响。3、Westernblotting的方法检测不同低氧培养时

5、间下肝癌HepG2和SMMC-7721細胞中Egr-1和自噬相关蛋白LC3及Beclin-1的表达情况。4、用腺病毒DNEgr_l或Egr-1抑制或过表达Egr-1，在常、低氧培养条件下，用qRT-PCR、Westernblotting和ChIP(染色质免疫共沉淀)检测转录因子Egr-1对LC3表达的调控作用。5、在肝癌HepG2細胞中感染腺病毒DNEgr-1后低氧培养4h，用免疫荧光的方法检测LC3的分布情況。结果：1、肝癌HepG2和SMMC-7721細胞感染腺病毒GFP或DNEgr-1后，以0、1,25、2.5、5和10_的顺铀或

6、以0、0.125、0.25、0.5和lug/ml的多柔比星处理細胞，然后分别常氧、低氧培养24h，结果显示，两个細胞系中低氧都明显降低细胞对顺铂和多柔比星的敏感性，但化疗药物浓度过高或过低时，低氧对化疗药物細胞毒性的减少不明显，差异无统计学意义（P>0.05)。然而，在HepG2和SMMC-7721细胞中表达DNEgr-1,化疗药物浓度相对较低时可以部分逆转低氧诱导的肝癌細胞对顺铂和多柔比星敏感性的降低（/><0.05)。2、肝癌细江苏大学硕士学位论文胞在低氧条件下培养不同时间。結果显示，在HepG2細胞中Egr-1的本底表达水平很低，

7、但SMMC-7721細胞中基本没有表达；在两种細胞株中低氧处理〇.5h后表达水平都明显升高并且在lh时表达水平达到最大值，在4h时出现降低。LC3的表达水平在低氧0.5h出现明显升高，并在4h表达水平最高，Beclin-1的表达在两种细胞系中低氧4h时明显增高。3、肝癌細胞感染腺病毒DNEgr-1和GFP48h后再经常氧或低氧处理4h，过表达DNEgr-1明显抑制低氧诱导的LC3表达的增高，但在常氧条件下过表达Egr-1并不明显增加LC3的量。ChIP结果表明，外源表达的Egr-1可与LC3的启动子结合，而感染GFP对照腺病毒的细胞由于

8、Egr-1的表达水平低，Egr-1的抗体并没沉淀下LC3的启动子序列。在感染腺病毒GFP和DNEgr-1后低氧处理lh的实验组结果表明，低氧条件下Egr-1与LC3启动子结合，并且DNEgr-1可以抑制这种