川芎嗪对人肝癌多药耐药细胞abc家族的抑制作用 (1)

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1、华中科技大学博士学位论文摘要第一部分人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的建立一、人肝癌多药耐药细胞株BEL-7402/ADM的建立方法：以文献方法采用体外低浓度梯度递增联合大剂量间断冲击诱导的模式，建立人肝癌BEL-7402/ADM耐药细胞株。取对数生长期的亲本细胞6BEL-7402，常规消化细胞，按2×10个/瓶进行分瓶，加入终浓度为50nmol/L的阿霉素（adriamycin，ADM），24h换液，用PBS冲洗，胰酶进行消化，根据生长情况选择传代周期。低浓度持续诱导，弃去上清和死亡悬浮的细胞，加入新鲜培养液脱药培养，在细胞重新生长并达到覆盖2/3瓶壁时，加

2、入含ADM浓度为2000nmol/L的培养液进行大剂量冲击诱导，待存活细胞恢复生长增殖后，加入含ADM200nmol/L的培养液继续诱导，同上步骤依次建立ADM诱导浓度为600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L的人肝癌BEL-7402/ADM耐药细胞，实验最终采用ADM浓度为2000nmol/L的培养液中生长的BEL-7402/ADM耐药细胞为本次实验的耐药细胞组。结果：成功诱导人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM。倒置显微镜下人肝癌耐药细胞BEL-7402/ADM的细胞形态学观察结果，耐药细胞多为分片状、群集性增殖，细胞的多角性改变，棱角变少，呈梭形，胞浆的折光

3、性变大，细胞易被消化。二、MTT法测定人肝癌多药耐药细胞系BEL-7402/ADM的耐药倍数方法：取亲本细胞及耐药细胞，用0.25%胰酶消化处理对数生长期细胞，用4含8%FCS的RPMI1640培养液配成细胞悬液，每孔接种200µL，即2×10个mL，接种在96孔板上，设有空白对照组、阴性对照组、ADM组、5-FU组、VCR组和CDDP组，以上给药组均设5个浓度。在酶联免疫检测仪上选定490nm波长处测定OD值，参比波长为620nm。按下列公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率=（1－给药组平均OD值/对照组平均OD值）×100%.公式计算IC50值：lgIC50=Xm-I[

4、P-(3-Pm-Pn)/4]，Xm：lg最大剂量；I：lg(最大剂量/相邻剂量)；P：阳性反应率之和；Pm：最大阳性反应率；Pn：最小阳性反应率。耐药倍数(RI)=4华中科技大学博士学位论文(ICResistancegroup)/(ICParentalgroup)×100%.结果：MTT实验结果表明，ADM对亲本的BEL-7402以及耐药的BEL-7402/ADM的IC50值分别是（1.47±0.28）、（7.62±0.51）µmol/L；5－FU的IC50值分别是（4.56±0.72）、（21.53±2.47）µmol/L；VCR的IC50值分别是(8.98±0.30)

5、、（80.27±11.22）µmol/L；CDDP的IC50值分别是(1.2±0.04)、（10.67±2.14）µmol/L，对各药物的耐药倍数分别为：ADM5.18倍、5-FU4.72倍、VCR8.94倍、CDDP8.89倍。三、ADM不同诱导浓度对人肝癌细胞系BEL-7402中P-gp表达的影响方法：以Western-blot法检测在200、600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L不同ADM浓度诱导至稳定增殖的肝癌BEL-7402细胞的P-gp的表达。结果以各组P-gp/α-tublin与未诱导的亲本细胞（control组）的比值百分率（均值±标准差，X±S

6、D）表示。结果：以200、600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L不同ADM浓度稳定增殖的肝癌BEL-7402细胞，其P-gp的蛋白表达以亲本细胞P-gp/α-tublin（control组）为100％计，分别为(99.37±1.63)、(112.36±1.59)、(105.01±1.93)、(102.12±1.16)、(102.84±2.18)％，其中阿霉素浓度为200nmol/L时，P-gp表达与control组无差异，但当阿霉素浓度为600﹑800﹑1000﹑2000nmol/L时，蛋白表达明显增加（P＜0.05）。四、细胞周期分析方法：取对数生长期的BEL-

7、7402、BEL-7402/ADM细胞于流式细胞仪测定DNA含量并进行细胞周期分析。结果：细胞周期结果显示，耐药细胞G0/G1缩短，而G2/M、S期增加（P<0.05）(n=3)。五、流式细胞仪检测亲本细胞及耐药细胞内阿霉素的蓄积方法：将对数生长期的BEL-7402、BEL-7402/ADM细胞以8000nmol/L5华中科技大学博士学位论文ADM培养2h后，流式细胞仪检测细胞内ADM平均荧光强度。结果：FCM检测结果，以BEL-7402内荧光强度为100％计，耐药细胞BEL-7402/ADM内的平均荧光强度为(82.08±6