川芎嗪对人肝癌多药耐药细胞abc家族的抑制作用

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1、华中科技大学博士学位论文+ADM组＞亲本细胞＞Resistance+ADM组。实验表明，未加药的亲本细胞及耐药细胞无阿霉素的红色荧光，各组中亲本细胞中的阿霉素荧光最强，耐药组有所减弱，经TMP、VRP预处理后的耐药组荧光有所增强，说明TMP、VRP可使细胞内阿霉素的蓄积量增加。三、流式细胞仪检测川芎嗪对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM中ADM蓄积的影响方法：设阴性组、耐药组、TMP组、VRP组。接种于培养瓶中，阴性对照组加入新鲜培养液，逆转组加入川芎嗪至终浓度为600µmol/L，阳性对

2、照组（VRP），加入VRP至终浓度为5µmol/L，继续培养24h,加入ADM8000nmol/L，培养2h，以冰冷的PBS洗3次，胰酶消化为单个细胞悬液（不低于106个/mL）,流式细胞仪检测细胞内ADM平均荧光强度。激发光(λex)为480nm，发射光(λem)为575nm.结果：FCM检测结果，Parental组，Resistance+TMP组和Resistance+VRP组平均荧光强度分别为耐药细胞Resistance组的(121.83±23.2)%(P<0.01)、(163.78±39.

3、5)%(P<0.01)、(320.1±47.18)%(P<0.01)。表明TMP能使细胞内的阿霉素蓄积增加，与VRP相似。四、HPLC法检测TMP对细胞内ADM浓度的影响方法：设亲本组、耐药组、TMP组、VRP组。将TMP组、VRP组分别在TMP（600µmol/L）或VRP（5µmol/L）中预培养3h，所有组再以8000nmol/LADM培养2h，以HPLC检测细胞内ADM浓度。以目标药与内标的峰面积的比值为横坐标，以药物的浓度为纵坐标，做标准曲线，并考察重现性、精密度、加样回收率、稳定性等。

4、实验结果以盐酸阿霉素（分子量579.99）浓度单位折算为nmol/L。结果：HPLC结果显示，ADM在0.1-40000ng/mL的范围内具有良好的线性关系。检测限(LOD)为0.05ng/mL，RSD为0.407。标准曲线为：C=47.73A+23.62(r=0.998)，其中C为阿霉素浓度，A为阿霉素与alprazolam的峰面积比值。实9华中科技大学博士学位论文验数据显示，亲本细胞摄入阿霉素的量为（2.45±0.52）µmol/L，耐药细胞对阿霉素摄入减少至（2.06±0.40）µmol/L

5、，TMP可逆转耐药情况而使阿霉素的蓄积量超过亲本细胞的水平。实验数据还表明，川芎嗪在使细胞内阿霉素浓度蓄积增加的同时，川芎嗪本身在细胞内的蓄积并未增加，说明川芎嗪并非P-gp底物，它使细胞内阿霉素浓度增加并非属于与阿霉素竞争受体结合位点所致。五、川芎嗪对人肝癌多药耐药细胞BEL-7402/ADM中MDR1、MRP2、MRP3、MRP5mRNA表达的影响方法：设耐药组、TMP组、VRP组。将TMP组、VRP组分别在TMP（600µmol/L）或VRP（5µmol/L）中预培养3h，所有组再以8000

6、nmol/LADM培养2h，采用PCR检测MDR1,MRP2,MRP3和MRP5mRNA表达水平。结果：实验结果以耐药组（resistance）为100%，计算得各组值。结果显示，TMP可使MDR1,MRP2,MRP3和MRP5mRNA表达分别达到耐药组的（0.67±0.3）、（0.85±0.10）、（0.90±0.04）、（0.63±0.11），与耐药组比较均有统计学差异(P<0.05)，但VRP组除MDR1mRNA表达与阴性对照组有差异外，其余组无差异(P<0.05)。六、川芎嗪对人肝癌多药耐

7、药细胞BEL-7402/ADM中P-gp、MRP2、MRP3、MRP5蛋白表达的影响方法：细胞分设耐药组、TMP组、VRP组。将TMP组、VRP组分别在TMP（600µmol/L）或VRP（5µmol/L）中预培养3h，所有组再以8000nmol/LADM培养2h，采用免疫印迹检测P-gp、MRP2、MRP3、MRP5蛋白表达水平。结果：结果表明TMP可使MDR1，MRP2，MRP3和MRP5蛋白表达 分别下调至阴性对照组(以1.0计)的（0.49±0.04）、（0.61±0.13）、(0.38±

8、0.14）、 （0.68±0.07）(P<0.01)。P-gp、MRP2、MRP3及MRP5蛋白表达下降。(P<0.05) 但VRP组除P-gp表达下降（0.44±0.08）(P<0.01)外，其余蛋白表达无差异，与 mRNA结果一致。10华中科技大学博士学位论文结论1．川芎嗪（Tetramethylpyrazine，TMP)自中药川芎中分离，有研究表明 其对HCC的耐药有作用，可能与逆转P－gp有关，但仍然未见是否与逆转其它 蛋白有关。本研究探讨了TMP对人肝癌多药耐药细胞BEL