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《应用PCR-直接测序法测定结核分支杆菌rpsL基因突变的研究.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、·202·中国抗生素杂志1999年6月第24卷第3期应用PCR-直接测序法测定结核分支杆菌rpsL基因突变的研究X吴雪琼 张俊仙 庄玉辉 张军芝 贾树林(解放军309医院, 北京100091) 摘 要 目的:了解我国结核分支杆菌耐链霉素(Streptomycin,SM)分离株rpsL基因突变情况,建立快速检测结核分支杆菌耐药基因型的分子药敏试验方法。方法:通过聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)2单链构象多态性(Single2strandedConformationPolymorphism,SSCP)、PCR2限制性片段
2、长度多态性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)和PCR2直接测序法(DirectSequencing,DS)分析38株结核分支杆菌耐SM分离株的rpsL基因。结果38株耐SM分离株中,25株SSCP异常、不被MboÊ消化、DS分析43位密码子AAG→AGG突变;1株SSCP异常、可被MboÊ消化、DS分析33位密码子GTA→ATA突变;12株SSCP正常、可被MboÊ消化、DS分析未见异常;未发现88位密码子突变。结论:大多数结核分支杆菌耐SM是由于其rpsL基因43位密码子突变所致,采用PCR2SSCP
3、、PCR2RFLP和PCR2DS方法可快速测定部分结核分支杆菌SM耐药基因型。关键词 聚合酶链反应; 单链构象多态性; 限制性片段长度多态性; 直接测序法; 药物耐受性;结核分支杆菌 结核病的耐药问题已引起国内外广大结核防治工采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA,置作者的高度重视,结核分支杆菌耐药分子机制的研究-20℃保存备用。正在不断深入,目前已阐明大多数结核分支杆菌分离1.3PCR扩增株耐SM是由于其核糖体S12蛋白基因(rpsL)突变所PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25Ll反应体致,其突变位点主要是43位密码子,该位点有限制性内系中,4种d
4、NTP的终浓度各为0.2mmolöL,引物切酶MboÊ的识别序列[GAAGGA(8ö7)],发生A→(INS1、2和S1、2)的终浓度各为0.4LmolöL,纯化的G突变后,使赖氨酸(Lys)密码子(AAG)突变成精氨DNA模板10～100ng,TaqDNA聚合酶1U。置DNA酸(Arg)密码子(AGG),酶切位点消失;少数链霉素耐热循环仪扩增后,在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产药分离株是在88位密码子发生类似突变,但该部位无物。引物INS1和INS2扩增结核分支杆菌复合群插入[1][2]酶切位点。我们以前已报道通过PCR2SSCP方法来序列IS986产生
5、245bp片段;根据结核分支杆菌rpsL筛选有rpsL突变的结核分支杆菌临床分离株,然后用基因序列(GenbankaccessionnumbleL08011)设计的PCR2RFLP方法初步确定突变的部位和性质,以便判引物S1和S2可扩增该基因序列产生267bp片段。断结核分支杆菌的耐药基因型,指导临床治疗。本文通1.4SSCP分析过进一步研究建立了PCR2DS,应用该方法直接测定rpsL扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中电38株结核分支杆菌耐SM分离株的rpsL基因序列,了泳,溴化乙锭染色或银染色后观察结果并照相。解我国该基因突变部位、性质及发生率,探讨
6、该方法潜1.5RFLP分析在的应用价值。限制性内切酶MboÊ购自华美生物工程公司,酶1 材料与方法切反应按厂家说明进行。rpsL基因扩增片段经该酶消1.1 菌株来源和药敏试验化后,在2%琼脂糖凝胶上电泳、溴化乙淀染色分析。结结核分支杆菌标准株来源于中国药品生物制品鉴核分支杆菌rpsL基因若无43位氨基酸密码子突变的定所;所选择的38株结核分支杆菌耐SM分离株分别菌株可被消化产生2个较小的片段(分别为177bp和来源于北京市结核病防治所、河北省胸科医院和上海90bp);若有该位点突变的菌株不被消化,电泳仍可见市结核病防治中心,按全国结核病细菌学检验标准化26
7、7bp片段。规程进行分支杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验。1.6DS分析1.2 细菌DNA的制备采用Promega公司生产的fmolDNA测序试剂X吴雪琼:女,生于1963年,硕士,副研究员。©1995-2006TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.应用PCR2直接测序法测定结核分支杆菌rpsL基因突变的研究 吴雪琼等·203·盒。除了以S1和S2为测序引物外,另设计合成2个内部支杆菌临床分离株的rpsL和rrs基因,77株SM敏感株引物S3和S4为测序引物,分别测定rpsL含43位和88在上
8、述两个基因部位均未发现突变;107株SM耐药分离32位密码子的序列
