结核分支杆菌与非结核分支杆菌快速鉴别实验研究

《结核分支杆菌与非结核分支杆菌快速鉴别实验研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、吉林大学硕士学位论文摘要近十余年来，分支杆菌感染尤其是结核病的发生率在发达国家呈上升趋势，且仍然是发展中国家严重的公共卫生问题.在我国，结核病仍然是常见病，多发病，而在结核病患病率较低地区(如美国，法国，英国)非结核分支杆菌病患病率相对较高.在美国和欧洲一些国家，近年来爱滋病(AIDS)患者和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者合并感染非结核分支杆菌和结核分支杆菌有上升趋势。因之，对非结核性分支杆菌的研究日益受到重视，由于结核分支杆菌与非结核分支杆菌在临床上引起的疾病无论从临床症状还是X线表现上都难以区别，而两者对抗结核药物敏感性不大相同，多数非结核分支杆菌对抗结核药物有天然耐药性，故正确

2、鉴定分支杆菌菌种，为临床医生提供快速准确检测和鉴定结核分支杆菌与非结核分支杆菌的方法，在疾病的诊断和治疗中致关重要。本实验包括实验室工作和临床工作两部分，在实验室工作中，我们对购得的八种分支杆菌国际标准株，结核分支杆菌(人型)非结核分支杆菌(鸟、胃、堪萨斯、龟、土地、不产色、蟾蛤)及作为实验对照的细菌菌株(金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌肺炎链球菌、绿脓杆菌肺炎克雷白杆菌)均采取煮沸法提取其细菌的基因组DNA;在临床工作中，我们采集84例临床诊断为结核病的患者及45例临床诊断为其他呼吸系统疾病的患者的疾及胸水标本，采用TritonX-100裂解煮沸法提取标本中的DNA。以上述DNA

3、为模板，参照Telenti等及Tostch等的设计方法，应用三对分别对吉林大学硕士学位论文应于分支杆菌65000表面抗原，结核分支杆菌插入序列I8110及人类(i-珠蛋白基因的部分序列的特异性寡核普酸引物，进行多重PCR扩增，扩增反应体系设为10卯1，其中含10“多聚酶缓冲液l0}LlodNTP各200mmol几，三对引物各0.5mmol几，模板DNA6p1,TagDNA多聚酶5U，余体积用ddH20补齐.震荡混匀后加入一滴石蜡油覆盖于反应体积表面，应用PCR仪进行扩增:94℃充分变性4分钟，接续94℃变性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟，共循环35次，最后增加一次720C9

4、分钟延伸。其扩增产物分别为439bp,1236p，和268bp。并应用BstEII和HaeIII两种限制性内切酶对经过回收及纯化的439bp产物分别进行限制长度多态性的分析。实验全过程可在1天内完成.结核分支杆菌DNA经多重PCR扩增可见到439bp,123bp两个片段，而非结核分支杆菌仅见439bp片段。相应的临床标本均可见268bp。实验中用于对照的所有细菌DNA经PCR扩增后电泳均无上述特异性扩增片段出现.所有分支杆菌标准菌株的439bp片段均能够被BstE11和HaeIII两种限制性内切酶所消化并表现出不同的酶切图谱。将129例临床标本进行培养，涂片，和多重PCR联合限制性内切

5、酶分析(t-PRA)检测，45例非结核性标本三者均为阴性;84例结核性标本中，三者阳性率分别为8.3%,17.8%和47.6%。在多重PCR检测阳性的40例临床标本中80%通过使用BstE11及HaeIII两种限制性内切酶消化，均可得到与实验室所用结核分支杆菌标准菌株H37RV相同的酶切图谱。另外20%经酶切后无法看到酶切片段。且通过t-PRA检测，发现1例非结核性分支杆菌吉林大学硕士学位论文感染病例，并具体鉴定感染菌种为龟分支杆菌龟亚型。多重PCR联合限制性内切酶分析方法有助于避免单纯PCR检测中的假阴性和假阳性问题，能够快速准确的鉴别结核分支杆菌和非结核分支杆菌的标准株，具有高度的

6、灵敏性和特异性.临床实验证明其在标本中细菌数量上的要求远远低于其他方法，具有一定的可行性，能帮助临床从病原学上区别肺结核与非结核分支杆菌(NTM)A市病。但欲求应用酶切方法将临床标本中的分支杆菌分类至亚种水平，尚有一定局限性，需进一步探索。关健词聚合酶链式反应限制性内切酶分析结核分支杆菌非结核分支杆菌吉林大学硕士学位论文AbstractObject:ToprovaidamethodforrapiddetectingandidentificatingofMycobacteriatuberculosisandMycobacterianontuberculosisexactlyforclin

7、icaldoctors.Method:Threecouplesofspecificoligonucleotideprimerswhichwererespectivelycorrespondingtothegeneenecodingfor65KdasurfaceantigenofMycobacteria;theinsertionsequence6110ofMycobacteriatuberculosisandthepartialrankofhum