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《应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第9卷第3期中国现代医学杂志Vol.9No.31999年3月ChinaJournalofModernMedicineMar.1999·论著·应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉素耐药基因型解放军三O九医院结核病研究室(北京100091)吴雪琼 张俊仙 庄玉辉张晓刚 李国利 何秀云目的:了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况,建立快速检测耐药突变株的方法。方法:通过PCR-SSCP、PCR-RFLP和巢氏PCR-RFLP分析40株结核分支杆菌临床分离株和15例临床标本的rpsL基因突变的部位和性质。结果:10株药物敏感株的rpsL双链泳动正常
2、、并可被MboⅡ消化;30株耐SM分离株中,25株双链泳动异常,24株不被消化;15例临床标本中,常规PCR扩增7例rpsL阳性,巢氏PCR15例均阳性,4例rpsL双链泳动异常、并不被MboⅡ消化。结论:通过常规PCR-SSCP和PCR-RFLP可快速检测结核分支杆菌耐SM分离株43位密码子点突变,而通过巢氏PCR-RFLP可直接检测大多数临床标本中结核分支杆菌SM耐药基因型。关键词 聚合酶链反应 单链构象多态性 限制性片段长度多态性 药物耐受性 分支杆菌 结核分类号 R378.91 我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重,而于中国药品生物制品鉴定所;40株结核分支
3、杆菌临常规的药敏试验方法需数周时间,BACTEC法也需床分离株来源于河北省胸科医院,15例结核性痰和7～10d,这不利于尽早开展有效的抗结核化疗,阻止支气管灌洗液标本来自我院结核科根据X线检查、耐药菌播散。因此,随着抗结核药物耐药分子机制临床表现、结核病史、涂片、培养或抗结核疗效而确的深入研究,建立了多种分子生物学技术检测结核诊为肺结核的患者,目前患者均已好转出院。分支杆菌的耐药基因型,如聚合酶链反应(Poly21.2 细菌和临床标本DNA的制备meraseChainReaction,PCR)-单链构象多态性采用本室自制的标本前处理试剂盒提取DNA,(Single-s
4、trandedConformationPolymorphism,SS2置-20℃保存备用。[1,2]CP)分析、PCR-限制性片段长度多态性(Re21.3 涂片和培养strictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)分将临床标本按全国结核病细菌学检验标准化规[3][4]析、PCR-直接测序(DirectSequencing,DS)法程进行萋—尼氏抗酸染色镜检和分支杆菌培养,培等等,我们应用这三种方法直接检测结核分支杆菌养阳性的菌株进一步进行菌种鉴定和药敏试验。临床分离株的耐药基因型均取得良好效果;但这些SM耐药标准:10μg/ml。方法
5、直接用于检测临床标本的敏感性还有待提高,1.4 常规PCR和巢氏PCR扩增它们只能检测涂片阳性的标本。鉴于链霉素(SM)PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25μl反耐药主要是由于其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)应体系中,4×dNTP的终浓度各为0.2mmol/L,引突变所致,突变位点主要位于第43位密码子,结核物(INS1、2,S1、2和S3、4)的终浓度各为0.4mmol/分支杆菌SM敏感株在该位点是赖氨酸密码子L,TaqDNA聚合酶1U。常规PCR时,纯化的(AAG),有限制性内切酶MboⅡ的识别序列DNA模板10～100ng或临床标本2～3μl;巢氏PCR
6、[GAAGGA(8/7)],本课题应用巢氏PCR-RFLP扩增时,取常规PCR扩增产物1μl作为DNA模板。分析结核分支杆菌临床分离株和直接分析临床标本置DNA热循环仪扩增后,在2%琼脂糖凝胶中电泳中结核分支杆菌的rpsL基因,以探讨其作为新的分检测扩增产物。引物INS1和INS2扩增结核分支子药敏试验方法的应用价值。[5]杆菌插入序列IS986产生245bp片段;根据结核分支杆菌rpsL基因序列(Genbankaccessionnumble1 材料与方法L08011)设计的一对外引物S1,2可扩增该基因序1.1 菌种、菌株和标本来源列产生267bp片段,一对内引物S
7、3,4可扩增该基因16种分支杆菌和5种非分支杆菌标准株来源序列产生215bp片段。·1·©1995-2006TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.中国现代医学杂志第9卷1.5SSCP分析2.4 常规PCR,SSCP和RFLP分析PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中以结核分支杆菌标准株DNA为对照,用引物电泳,银染色后观察结果并照相。INS1和INS2扩增上述40株结核分支杆菌分离株1.6RFLP分析和15例临床标本DNA均产生245bp片段,进一步限制性内切酶MboⅡ购自华美生
