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《应用巢氏PCR-RFLP直接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉素耐药基因型.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、应用巢氏PCR-RFLPH.接检测结核病临床标本中结核分支杆菌链霉索耐药基因型中国现代医学杂志1999年第9卷第3期吴雪琼张俊仙庄玉粋张晓刚李国利何秀云目的：了解结核分支杆菌链霉素耐药基因突变情况，建立快速检测耐药突变株的方法。方法：通过PCR-SSCP、PCR-RFLP和巢氏PCR-RFLP分析40株结核分支杆菌临床分离株和15例临床标本的rpsL基因突变的部位和性质。结果：10株药物敏感株的rpsL双链泳动正常、并可被MboII消化；30株耐SM分离株中,25株双链泳动异常,24株不被消化；15例临床标本中，常规PCR扩增7例rpsL阳性，巢氏PCR15例均阳性
2、，4例rpsL双链泳动异常、并不被MboII消化。结论：通过當规PCR-SSCP和PCR-RFLP可快速检测结核分支杆菌耐SM分离株43位密码子点突变，而通过巢氏PCR-RFLP可克接检测大多数临床标本中结核分支杆菌SM耐药基因型。关键词：聚合酶链反应单链构象多态性限制性片段长度多态性药物耐受性分支杆菌结核我国的结核病疫情和耐药情况都相当严重，而常规的药敏试验方法需数周时间，BACTEC法也需7〜1(M,这不利于尽早开展有效的抗结核化疗，阻止耐药菌播散。因此，随着抗结核药物耐药分子机制的深入研究，建立了多种分子生物学技术检测结核分支杆菌的耐药基因型，如聚合酶链反应(
3、PolymerasechainReaction,PCR)-单链构象多态性(Single-strandedConformationpolymorphism,SSCP)分析［1,2］、PCR-限制性片段长度多态性(ReslricfionfragmentLengthPolymoiphism,RFLP)分析［3］、PCR-直接测序(Directsequencing,DS)Ji［4］等等,我们应用这三种方法fT•接检测结核分支杆菌临床分离株的耐药基因型均取得良好效果；但这些方法直接用于检测临床标本的敏感性还有待提高，它们只能检测涂片阳性的标本。鉴于链霉素(SM)耐药主要是山于
4、其核糖体蛋白S12编码基因(rpsL)突变所致，突变位点主要位于第43位密码子，结核分支杆菌SM敏感株在该位点是赖氨酸密码子(AAG),有限制性内切酶MboII的识别序列［GAAGGA(8/7)］,本课题应用巢氏PCR-RFLP分析结核分支杆菌临床分离株和直接分析临床标本中结核分支杆菌的rpsL基I大］,以探讨其作为新的分子药敏试验方法的应用价值。1材料与方法1.1菌种、菌株和标本来源16种分支杆菌和5种非分支杆菌标准株來源于中国药品生物制品鉴定所；40株结核分支杆嚙临床分离株来源于河北省胸科医院，15例结核性痰和支气管灌洗液标木来
5、'
6、我院结核科根据X线检查、临床
7、表现、结核病史、涂片、培养或抗结核疗效而确诊为肺结核的患者，目前患者均已好转出院。1.2细菌和临床标本DNA的制备采用本室自制的标本前处理试剂盒提収DNA,置・20°C保存备用。1.3涂片和培养将临床标本按全国结核病细菌学检验标准化规程进行萋一尼氏抗酸染色镜检和分支杆菌培养，培养阳性的菌株进一步进行菌种鉴定和药敏试验。SM耐药标准：lOug/ml。1.4常规PCR和巢氏PCR扩增PCR扩增试剂盒为本室自制产品。在25卩1反应休系中，4XdNTP的终浓度各为0.2mmol/L,弓
8、物(INS1、2,Sk2和S3、4)的终浓度各为0.4mmol/L,TaqdNA聚合酶1
9、U°帘规PCR时，纯化的DNA模板10-100ng或临床标本2〜3ul；巢氏PCR扩増时，収常规PCR扩增产物1u1作为DNA模板。HDNA热循环仪扩增后，在2%琼脂糖凝胶中电泳检测扩增产物。引物INS1和INS2扩增结核分支杆菌插入序列IS986产生245bp片段［5］；根据结核分支杆菌rpsL基因序歹iJ(GenbankaccessionnunibleL08011)设计的一对外引物S1,2可扩增该基因序列产生267bp片段，一•对内引物S3,4可扩增该基因序列产生215bp片段。1.5SSCP分析PCR扩增产物在8%非变性聚内烯酰胺凝胶中电泳，银染色后观察结果并
10、照相。1.5RFLP分析限制性内切酚MboII购自华美生物工程公司，酚切反应按厂家说明进行。引物S3,4的扩增片段经该酶消化眉，在8%非变性聚内烯酰胺凝胶屮电泳，银染色后观察结果。结核分支杆菌「psL基因若无43位氨基酸密码子突变的菌株可被消化产生两个较小的片段(分别为160bp和55bp)；若有该位点突变的菌株不被消化，电泳仍可见215bp片段。2结果2.1结核分支杆菌临床分离株的药敏试验在40株临床分离株中，一药物敏感株10株：耐SM分离株30株。2.2结核性临床标本的涂片、培养和谿敏试验15例结核性临床标本中，2例涂片和培养阳性、药敏试验为耐SM,RFP和
