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第29卷第2期质谱学报Vol.29No.22008年3月JournalofChineseMassSpectrometrySocietyMar.2008应用质谱中性丢失扫描鉴定狗血浆中硝唑尼特Ⅱ相代谢物张丽芳,刘元元,薛飞群(中国农业科学院上海兽医研究所,农业部寄生虫病学重点开放实验室,上海200232)摘要:硝唑尼特经狗口服后在体内迅速代谢成替唑尼特,随后替唑尼特进一步与葡萄糖醛酸结合生成了葡萄糖醛酸替唑尼特结合物。本实验主要运用了三重四极杆串联质谱的中性丢失扫描功能,并结合质谱的全扫描功能和酶解试验,成功地对该硝唑尼特Ⅱ相代谢物进行了鉴定。关键词:硝唑尼特;替唑尼特;中性丢失扫描中图分类号:O657.63文献标识码:A文章编号:100422997(2008)022101204ApplicationofNeutralLossScanModeinMassSpectrometryforIdentificationofthePhaseⅡMetaboliteofNitazoxanideinDogPlasmaZHANGLi2fang,LIUYuan2yuan,XUEFei2qun(ShanghaiVeterinaryResearchInstitute,CAASKeyLabofAnimalParasitologyinAgriculturalMinistry,Shanghai200232,China)Abstract:Nitazoxanide,anewbroad2spectrumparasiticidalagentwasrapidlydeacetylatedtotizoxanide,followedbytheformationofglucurono2conjugateafterdogoraladministration.Inthisexperiment,neutrallossscanandfullscanmodeoftriplequatrupolemassspectrom2eterandenzymehydrolysiswereusedtoidentifytheglucuronideoftizoxanide.Theresultsshowthatneutrallossscanisausefultoolforidentificationofconjugatemetabolites.Keywords:nitazoxanide;tizoxanide;neutrallossscan中性丢失扫描是三重四极杆串联质谱仪所代谢物,并鉴定出其结构。目前这种扫描方式已[1]独有的数据采集方式之一,它的主要工作原理是越来越广泛地应用在药物代谢研究方面。许一级质谱(MS1)和二级质谱(MS2)同时扫描,而多研究证明葡萄糖醛酸结合物发生碰撞诱导解MS2与MS1始终保持质量差Δm,最终的图谱离时,丢失一个中性的葡萄糖醛酸(176u),电荷将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性滞留在药物的碎片上,而且在正离子或负离子扫碎片(Δm)的离子。由于多数药物的代谢物保留描中均可观察到这一碎裂作用。因此中性丢失了原药分子的骨架结构或一些亚结构,丢失一些碎片(176u)扫描可用来筛选样品中是否有葡萄相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子,应糖醛酸结合物存在。用中性丢失扫描可迅速找到具有特定官能团的硝唑尼特(nitazoxanide,简称NTZ)是一种收稿日期:2007208206;修回日期:2007211227作者简介:张丽芳(1970～),女(汉族),上海人,副研究员,从事药物分析研究。E2mail:yuanzhexiao@yahoo.com.cn通信作者:薛飞群(1956～),男(汉族),山西人,研究员,从事新兽药研究。E2mail:xuefeiqun@online.sh.cn 102质谱学报第29卷抗寄生虫新药,用于治疗线虫、绦虫、吸虫等寄生管。A管加入2mL乙腈,漩涡混匀2min,-1虫病,现特别用于治疗隐孢子虫(Crytosporidi212000r·min离心10min,取上清液,45℃水[2]umparvum)感染所引起的腹泻等,NET及其浴中氮气流下吹干,再加入300μL乙腈溶解,得主要代谢产物的化学结构示于图1。据文献[3]A样。B管加入100μLpH4.3的醋酸2醋酸钾报道,该药口服后在体内迅速被代谢成具有活性缓冲液,震荡后加入10μLβ2gllucuronidase,混的替唑尼特(tizoxanide,简称T),然后被葡萄糖匀后放入37℃恒温箱中过夜后取出,加入2mL醛酸化为葡萄糖醛酸替唑尼特(tizoxanideglu2乙腈,以下操作同A管,得B样。[4]curonide,简称TG)。Broekhuysen等采用单T对照样品制备:取T对照品适量,加入2极质谱在人的尿样中检测到分子离子m/z440mL乙腈溶解。样品进样前均用微孔过滤膜和m/z264,通过它们之间相差176u来推测尿过滤。样中T结合物TG的存在。本工作旨在采用三1.4实验条件重四极杆串联质谱中性丢失扫描并结合酶解试采用电喷雾离子化源(ESI);负离子模式;验,建立一种快速定性鉴定硝唑尼特Ⅱ相代谢物毛细管电压:2.50kV;锥孔电压:25V;碰撞能的方法。量:15eV;源温100℃;脱溶剂温度:300℃;脱-1溶剂气(N2):200L·h;碰撞气:Ar。采用注射泵直接进样分析;注射泵流速为10μL-1·min。2结果与讨论采用电喷雾正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)分析样品,结果发现负离子模式检测得到的信号强,而正离子模式不显信号。这可+能与代谢物的化学结构-OH易失H而带负电有关,因此选用电喷雾负离子模式进行检测。图1NTZ及其主要代谢产物的化学结构对A样进行质谱全扫描,结果显示样品中-Fig.1ChemicalstructruesofNTZ存在[M-H]m/z264和m/z440离子,示于anditsmainmetabolites图2;对m/z264进行子离子扫描(图3B),子离子谱显示主要的子离子为m/z114、144、190、217,其子离子谱与T的子离子扫描图谱(图1实验部分3A)完全一致,表明m/z264对应的代谢物为1.1仪器T;离子m/z264与m/z440相差176u,而176Quattromicromass串联质谱仪:美国Wa2的差值正好与葡萄糖醛酸的相对分子质量相一ters公司产品;氮吹仪:北京康林公司产品;致,因此初步推断出m/z440离子对应的代谢物SORVALLRC5C离心机;涡旋混合器XW2是T的葡萄糖醛酸结合物TG。0A:上海医科大学仪器厂产品。为了进一步证实TG的存在,在负离子模式1.2试剂下选择脱氢葡萄糖醛酸的相对分子质量176对NTZ混悬剂、T对照品:自制;β2glucuroni2A样作中性丢失扫描。结果显示样品中存在准-dase:Sigma公司产品;醋酸、醋酸钾:分析纯,上分子离子[M-H]m/z440的化合物,示于图海国药集团产品;乙腈:HPLC级,Fisher公司产4,这说明此化合物是含葡萄糖醛酸的结合物,而-品;实验用水为去离子水。且它与TG的准分子离子[M-H]相对分子质1.3样品的制备量相一致。-1健康狗口服100μg·kg剂量NTZ混悬为进一步证明m/z440就是替唑尼特的葡剂,给药7h后采集血样,离心取血浆样。各取1萄糖醛酸结合物,进行酶水解对照实验(B血浆mL血浆样置于两个离心管中,分别为A管和B样)。对B样进行质谱全扫描,结果显示质谱图 第2期张丽芳等:应用质谱中性丢失扫描鉴定狗血浆中硝唑尼特Ⅱ相代谢物103中已找不到m/z440离子,但仍有m/z264离采集方式是一种非常有用的鉴定药物Ⅱ相代谢子,示于图5,说明结合物已经被β2gllucuroni2产物的手段。由于其独特的专属性和高灵敏性,dase催化水解为T。不仅可以避免复杂、繁琐、耗时的分离纯化Ⅱ相综上分析,m/z440离子对应的代谢物就是代谢产物的工作,而且能鉴定难于辨别的痕量Ⅱ硝唑尼特Ⅱ相代谢产物TG。相代谢产物,从而迅速方便地解决问题。三重四极杆串联质谱的中性丢失扫描数据图2A样全扫描质谱图Fig.2FullscanspectrumofsampleA图3m/z264的子离子质谱图A:T对照品;B:A样Fig.3Daughterscanspectraofm/z264A:tizoxanide;B:sampleA 104质谱学报第29卷图4A样中性丢失扫描质谱图Fig.4NeutrallossscanspectrumofsampleA图5B样全扫描质谱图Fig.5FullscanspectrumofsampleB参考文献:inman[J].IntJClinPharmacolTher,2000,38[1]常雁,再帕尔·阿不力孜.串联质谱新技术及其(8):3872394.在药物代谢研究中的应用进展[J].药学学报,[5]STOCKISA,DEROUBAIXX,LINSR,etal.2000,35(1):73278.Pharmacokineticsofnitazoxanideaftersingledose[2]林学良,梁国栋,夏中宁.RP2HPLC法测定硝唑尼oraladministrationin6healthyvolunteers[J].Int特含量及有关物质的方法学研究[J].药物分析杂JClinPharmacolTher,1996,34(8):3492351.志,2004,24(3):2472249.[6]STOCKISA,ALLEMONA,BRUYNDS,etal.[3]陈阜新.硝唑尼特———一种新的抗原虫药[J].中Nitazoxanidepharmacokineticsandtolerabilityin国药师,2004,7(5):3942395.manusingsingleascendingoraldoses[J].IntClin[4]BROEKHUYSENJ,STOCKISA,LINSRL,etPharmacolTher,2002,40(5):2132220.al.Nitazoxanide:pharmacokineticsandmetabolism
