ZEB1在大鼠肝星状细胞激活及转分化中的作用.pdf

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1、1．923中的作用⋯⋯⋯1前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10日IJ舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l3结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯30结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯35英汉缩略词对照表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39致{射⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40MicroRNAs在未分化甲状腺癌侵袭转移中的调控作用⋯41345石7盘●_工，_■，-▲1

2、●_．●I_l，上I＼＼㈣嬲ZEBl在大鼠肝星状细胞激活及转分化中的作用摘要’目的：本实验中利用ELISA、MTT和WesternBlotting等实验检测的方法，探究ZEBl在肝星状细胞激活及转分化中的作用，并通过刺激肝星状细胞活化的方法来观察TGF．D信号通路的功能及效应。证明乙醛刺激肝星状细胞能上调ZEB1的表达进而使肝星状细胞激活并转分化。方法：首先，采用SB．431542特异性阻断TGF．p信号通路结合乙醛刺激HSC细胞，Westernblotting检测HSC内ZEB1、0c．SMA、Smad3和P．Smad3．$425的表达。接着乙醛刺激肝星状细胞并设置不同的刺激时间

3、，可通过MTT法来检测活化肝星状细胞的增殖水平；通过ELISA法测定肝星状细胞内纤维粘连素FN以及胶原蛋白I含量，①将细胞株分组为：(1)正常培养12d'时，(2)正常培养24／1"时，(3)正常培养36d'时，(4)SB．431542处理后正常培养24d'时，(5)SB．431542处理后乙醛24小时刺激培养，(6)乙醛12d'时刺激培养，(7)乙醛24d',时刺激培养，(8)乙醛36d,时刺激培养。培养相应组的细胞到细胞融合度为70％至80％时，用胎牛血清含量为0．4％的DMEM培养基培养12小时即是对各组细胞进行了同步化处理，之后再用胎牛血清含量为10％的DMEM完全培养基进

4、行培养，其中24d'时SB．431542处理正常培养组细胞培养前先用抑制剂(SB．431542最终浓度是10pmol／L)进行处理，24d,时乙醛刺激SB．431542处理组给予乙醛刺激(最终浓度是2009mol／L)前先用对应的抑制剂(SB．431542最终浓度是109mol／L)预处理1小时，刺激满12d'时补加一次乙醛刺激。然后，收取细胞，对细胞总蛋白进行提取，用G250法测定细胞中总蛋白的含量，‘SDS．PAGE电泳对蛋白进行分离以及用WesternBlotting检测ZEBl、仅．SMA、Smad3和P—Smad3．$425的表达。图谱经QuantityOne软件进行处理

5、和分析，根据Western膜上的蛋白条带相应灰度值进行比较分析。②HSC．T6细胞株分组仍然同上。将HSC．T6细胞株接种到96j：L培养板中，每组设有3复孑L，随后的细胞同步化和相应试剂处理也同上。各组细胞处理完毕后，细胞生长的情况即可通过光镜进行观察，并通过ELLSA法检测胶原蛋白I和纤维粘连素FN的含量变化，以及利用MTT法检测细胞活性变化。结果：①正常培养对照组HSC中ZEBl、a．SMA和P．Smad3．$425的表达均有上调，说明HSC具有基础活性；乙醛刺激组较对照组显著上调ZEBl、a．SMA和P．Smad3．$425的表达；TGF．p通路阻断对ZEBl、0【．SMA

6、和P．Smad3．$4251拘表达上调均有明显的抑制作用。②肝星状细胞经乙醛刺激后可被激活，激活表现为：胶原蛋白I和纤维粘连素FN在ELLSA法检测中含量均有一定的增加，用MTT法检测出细胞增殖活性明显增强。说明乙醛可刺激肝星状细胞的激活。加入阻断剂后，MTT测定结果显示细胞活性明显下调，I型胶原蛋白(TIⅧI)和纤维粘连素(FN)含量也明显下调。③不同刺激时间比较得出：各项指标的改变随刺激时间延长逐渐增高，至24h达到最高峰，36h略有下降。结论：①乙醛对大鼠肝星状细胞的激活有明显的刺激作用，转录因子ZEBl的表达显著上调，HSC细胞大量增殖并转分化。②乙醛激活肝星状细胞的增殖及

7、转分化效应在24小时左右达最高峰。③乙醛可通过刺激TGF．p信号通路导致肝星状细胞激活并转分化，SB．431542特异性阻断TGF一13信号通路后可有效抑制乙醛激活HSC细胞。④转录因子ZEBl表达上调与TGF-p信号通路的激活及胶原蛋白等效应蛋白的表达上调存在相关性，说tfJZEBl在大鼠肝星状细胞的激活及转分化过程中发挥了重要作用。关键词：转录因子ZEBl；TGF．p信号通路；肝星状细胞；肝纤维化TheEffectsofZEB1onActivationand办an