Wnt信号通路在肝星状细胞活化中的作用观察

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1、摘要背景／目的：各种病因所引起的慢性肝病绝大多数都有肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)，其中25％----40％最终发展为肝硬化甚至肝癌，是一类世界性的严重危害人们健康的主要疾病。目前的研究证实，肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)的激活是肝纤维化发生的中心环节。各种因素通过不同方式和途径作用于肝脏中的HSC，导致其生物学及功能变化，引起肝纤维化。研究这群细胞复杂的病理生理机制将是抗纤维化治疗发展的关键。Wnt信号通路是近年来在分子生物学、细胞生物学和肿瘤研究中的一大热点，参与调控细胞的分化、癌变、凋亡及机体免疫、应激等生理

2、病理过程。最近有研究表明Wnt信号通路与HSC的活化及肝纤维化的发生相关，但有关Wnt信号通路相关分子在HSC活化中的作用尚无全面深入的研究。本课题首先利用基因芯片技术观察Wnt信号通路相关分子在HSC活化前后表达水平的变化，并用实时聚合酶反应(realtimePCR,RT-PCR)验证部分表达变化基因；进而观察外源性小鼠Wnt5a(recombinantMouseWnt5a，rmWnt5a)蛋白对HSC．T6增殖及I型胶原合成的影响；以期探讨Wnt信号通路在肝纤维化发生中的作用，进一步揭示肝纤维化的发生机制，为肝纤维化的防治提供新的可能途径及干预靶点。方法：(1

3、)．利用胶原酶／链蛋白酶灌注Nycodenz梯密度离心分离大鼠HSC，于体外培养。(2)．利用Affymetrix基因芯片观察在HSC活化前后基因谱表达水平的变化，结果中筛选出Wnt信号通路相关分子，以RT-PCR验证部分表达变化的基因。(3)．体外培养HSC．T6细胞，加入rmWnt5a蛋白，用CCK．8法检测其对HSC—T6的影响。(4)．用ELISA法观察rmWnt5a蛋白对HSC．T6合成I型胶原的影响。摘要结果：(1)．基因芯片结果显示，活化的HSC与新鲜分离的静止的HSC比较，表达上调的Wnt信号通路相关基因共13条(Wisp2、Wnt4、Fzd2、P

4、LC、PKC、TGF．fll、Wispl、TLE3、Ccnd2、Ccndl、DKK3、Will、RhoA)。经RT-PCR验证了其中2条(Wnt4、Fzd2)，结果与芯片检测结果一致。(2)．CCK．8实验结果显示，浓度在0．2p．g／mL--4)．8rtg／mL之间的rmWnt5a具有促HSC-T6增殖作用。当rmWnt5a浓度在0．2pg／mL-0．499／mL时，随着其浓度增长，对HSC．T6具有显著的浓度依赖性促细胞增殖作用p<0．05)。当rmWnt5a浓度在0．499／mL-4)．8rtg／mL时，仅有轻度浓度依赖性促细胞增殖作用的趋势，无统计学上的差

5、异∽0．05)。(3)．ELISA实验结果显示，HSC．T6培养细胞上清液中I型胶原含量随着rmWnt5a浓度增加而逐渐增加。rmWnt5a0．2肛g／rrd组，0．4rtg／ml组、O．8rtg／ml组与对照组相比，I型胶原含量均有显著性差异⑦

6、Aims：Majorityofc11romcliverdiseasesexistliverfibrosis，250／,．,-40％ofwhicheventuallyleadtolivercirrhosisorlivercancer．LiverfibrosisisakiIldoftheworldwidemajordiseasesthatseriouslythreathenspeople’Shealth．Thecurrentstudyhasconfirmedthattheactivationofhepaticstellatecellsisthecentrallinko

7、fliverfibrosis．AvarietyoffactorsactontheHSCindifferentwaysandmeans，leadingtoitsbiologicalandfunctionalchanges，whichresultinliverfibrosis．Itisthekeypointofanti-fibrosistherapydevelopmenttostudythecomplexpathophysiologicalmechanismofthesecells．Recentyears，Wntsignalingpathwayisoneofthema

8、jorho