实验二：营养器官组织培养.doc

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1、实验二营养器官组织培养一、实验目的与意义培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。通过本实验，领会无菌培养对实验材料消毒,接种的要求,初步掌握培养材料灭菌,接种的操作技术。此外，营养器官组织培养是最基本的植物纟I［织培养技术之一，本实验还要求初步掌握帘见园艺作物茎段的组织培养方法。二、实验器材超净工作台、银子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、培养皿等。三、实验药品及材料次氯酸钠、酒精、无菌水、柑橘等园艺作物茎段、培养基等。四、实验步骤（1）准备好培养基，无菌水，培养皿及接种工具。（2）将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上，打开超净台紫外灯开关，同吋打开接种室内的紫

2、外灯，用紫外灯照射至少25分蚀，然后关室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风十分钟后，再开曰光灯进行无菌操作。（3）接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒-次。（4）将柑橘等园艺作物茎段在流水下冲洗干净。（5）将茎段放于200ml的烧杯中，用75%的酒精溶液浸泡30s,无菌水冲洗，然后用2%次氯酸钠溶液（加入吐温2滴）浸泡15min,期间不断摇动溶液，用无菌水洗涤3—5遍待用。（6）用75%酒精擦洗（喷撒）接种台表面。（7）接种用的银子使用前插入95%的乙醇溶液中，使用银子时在酒精灯上烧片刻，冷却后待用。也可以插入培养基边缘促使其冷

3、却。（8）在酒精灯火焰旁揭去封口膜，将瓶口倾斜接近水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口（靠手腕的动作，使试管口沾染的少量菌得以烧死），左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的银子触动培养基部分，使其冷却，夹収斜切后的茎段，将其平放在培养基上，用银子轻轻按一下，使其部分浸入培养基。每瓶可放4-6个外植体。（9）转动瓶口灼烧，将封口膜从酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好细子，标上接种日期、材料名称、姓名等。（10）将接种材料移到培养室培养。注意：（1）从室外取得材料，要用白來水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时要用毛刷刷洗。（

4、2）外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素，瑕好选用两种消毒剂交替浸泡，初次实验灭菌时间耍设置一定的时间梯度来确定垠佳的灭菌时问。常用的消毒剂的见表1。（3）工作台接种时，应尽量避免做明显扰乱气流的动作（比如说、笑、打喷嚏），以免影响气流，造成污染。另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手。（4）接种前培养基出现大量污染现象，若菌类只存在于培养基衣而，且主耍是真菌时,可能是因培养瓶密封不严或放證培养基的环境不洁净，菌类种群密度过大所致。若菌类存在于培养基内部，则可能是山使用污染的贮藏母液引起。另外培养瓶不洁净，灭菌不彻底也是导致

5、接种前培养基污染的原因。避免此现象发生的方法是:保持环境洁净，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。（5）接种后培养基出现大面积污染、菌落分如不匀，此种情况主要是接种过程中发生的污染所致。可能是接种室不洁净、菌类泡子过多、银子带菌、操作人员手未彻底消毒、操作人员呼吸及超净工作台。出现故障等原因引起°避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30min；用75%酒椿喷雾杀菌降尘，超净台开启15-20min后方可使用；银子等接种工具严格彻底灭菌,口接种吋使用1次灭菌1次；操作过程中经常用75%

6、酒精等消毒剂擦洗手部等措施。（6）接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表而灭菌不彻底所致。解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-15min,自來水冲洗0.5-2h后，再选择适宜的灭菌剂消毒,—般用0.1-0.2%升汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。衣1植物纽•织培养中殆用的消毒剂消毒剂名称使用浓度（％）消毒难易灭菌吋间（min）消毒效果乙醇70〜75易0.1〜3好氯化汞0.1〜0.2较难2〜15垠好漂白粉饱和溶液易5〜30很好次氯酸钙9〜10易5〜30很好次氯酸钠2易5〜30很好过氧化

7、氢10〜12最易5〜15好五、思考题1、接种后污染调杳观察接种后7、14、21天的污染情况，填入下表:接种日期接种数污染数污染率主要污染菌种7d后14d后21d后注：污染率（%）=（污染的外植体数/总接种外植体数）X100%如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间短；若接种材料虽然没有污染,但材料已发黄，纽•织变软，表明消毒时间过长，纽织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染,生长正常，即可以认为消毒时间适宜。