临床医学论文猪脱细胞角膜基质的制备及组织学特征观察.doc

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1、临床医学论文・猪脫细胞角膜基质的制备及组织学特征观察作者：林旭初恵延年孟浩张勇杰金岩【摘要］日的：制备低抗原性、保留犬然角膜结构的组织工程角膜支架材料。方法：对猪角膜进行反复冻融联合酶消化，最后冷冻干燥，观察其组织学特征。结果：制备的脫细胞猪角膜基质的细胞成分能被冇效去除，材料保昭了利于角膜上丿支生长的基底膜和有序排列的网状的基质胶原结构，有一定的强度和韧性。结论：采用反复冻融联合酶消化、冷冻干燥法能获得一种无细胞的组织工程角膜支架材料。生物衍生材料脫细胞角膜基质组织工程Preparationandobservationofthehist

2、ologicalstructureoftheacellularporcinecornealstromaAbstractATM:Topreparethescaffoldofthetissueengineeringcorneawiththe1owerantigenandnativestructureofcornealstroma.METHODS:Theacellularporcinecornealstroma(APCS)waspreparedbythemeansofenzymaticdigestion,freezingandthawingan

3、dlyophi1ization,andthehistologicalstructureofAPCSwasobserved・RESULTS:Thecel1sintheporcinecornealstromacouldberemovedeffectively.TheAPCSretainedthebasementmembrane.Thestructureofstromalcollagenwasorderedandtough.CONCLUSION:TheAPCSpreparedbythemeansofenzymaticdigestion,free

4、zingandthawingandlyophi1izationisakindoftissueengineeringcornealscaffoldderivedfrombiologicmaterials.11hasthecharacterofthe1owerantigenandpossessingthenativestructureoftheconicalstromatofaci1itatethegrowthoftheseedcells・•KEYWORDS:biologicderivalionmaterials;acellularcorne

5、alstroma;tissueengineering0引言为解决临床角膜移植的供体不足和术后的排斥反应，组织工程角膜的硏究有着重大的医学价値，组织工程角膜的核11、就是要形成支架材料和种子细胞的复合体，在该复合体中，支架起着引导细胞生长的重耍作用，因此理想的支架材料的获得对组织工程角膜的硏究起着很大的推动作用。目前的组织工程支架材料有人工合成高分子、天然高分子和生物衍生材料等几大类。由于生物衍生材料来源于天然的组织，保留了原有组织的三维立体结构和细胞外基质，其保留的的化学信号可诱导和促进种子细胞的生长和分化，因此使用这类材料作为组织工程支

6、架材料冇一定的发展前景，目前用其作为组织丁•程角膜支架材料的硏究也在兴起，对材料的制备、保存方法已有多种报道。我们采取反复冻融联合酶消化法，对猪角膜进行系统脫细胞处理，并观察其组织学特征，以明确此种方法能否脫尽角膜组织111的细胞成分以减少材料的免疫原性，同时乂能保存天然角膜的一些结构特征以利于种子细胞的生长，为获得理想的组织工程角膜支架材料捉供一定的实验依据。1材料和方法1・1材料用本地屠宰场的猪，无眼疾，雌雄不限，摘取刚处死的猪整个眼球，用含抗菌素的磷酸盐缓冲液（PBS）充分洗涤，手术显微镜下切取约1/2厚的前板层角膜，三蒸水漂洗后，

7、3代下，置于2.5g/L的胰酶中消化30min（反复震荡），三蒸水震荡漂洗，放入-196°C液氮屮快速冷冻15min，取出后37°C水浴快速复温解冻止述冻融过程重复3次然后置于DNA-RNA酶中消化（667“kat/L）lh，三蒸水震荡漂洗，将材料置于低温冰箱（-80°C）预冻，转入冷冻干燥机中，真空干燥，持续16h左右。冻干的角膜材料，密封于无菌塑料包装袋中，钻60消毒，保存备用。1・2方法取冻干的角膜基质行100g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片后行常规HE染色。另取冻干的脫细胞角膜基质常规石蜡切片，脫蜡水化后，用5g/L的高碘酸水溶

8、液还原15min，蒸镭水洗5min，然后席夫氏试剂染色15min，再蒸馆水水洗分化lOmin。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。在25g/L戊二醛溶液中固定制备的角膜基质，用0・lmol/L磷酸