脱细胞角膜基质制备方法探究进展

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1、脱细胞角膜基质制备方法探究进展　　摘要：脱细胞角膜基质作为组织工程角膜的研究新热点，不仅保持了天然角膜的结构特征和力学性能，且含有人工合成支架所不具备的细胞生长因子等，为种子细胞生长提供了理想的环境，同时也去除了组织中可能引发免疫排斥反应的细胞成分。本文对最近几年异种脱细胞角膜基质的制备方法进行综述，并指出了各种方法的优缺点。关键词：脱细胞角膜基质组织工程制备方法中图分类号：R32文献标识码：A文章编号：1672-3791（2013）04（a）-0226-01异种脱细胞角膜基质作为组织工程角膜的支架具有免疫原性低、含多种细胞因子、机械强度好、可塑性好等优点。近年来，实验过程中采用兔、

2、牛、犬、猪等多种动物作为角膜供体，并获得了不同程度的移植效果。理想的脱细胞方法的目的是完全去除组织中的细胞成分及核物质，从而减少移植受者免疫反应，同时保持细胞外基质（ECM）的结构和功能蛋白，维持角膜的透明度，并且能够支持角膜细胞生长。现就脱细胞角膜基质的制备方法及各方法的优缺点进行综述。1物理制备方法1.1反复冻融法5反复冻融法是利用低温下细胞内部会产生冰晶，剩余的细胞液由于盐浓度增高而引起溶胀，再室温融解，反复多次即可使细胞结构破碎，从而使细胞内物质释放出来。单纯使用该方法，脱细胞效果并不理想，因此常联合其它脱细胞方法。1.2高静压技术高静压技术（HHP）的主要机理是使组织中细胞

3、的细胞膜损伤，并影响细胞内酶活力及细胞内营养物质和废弃物的运输，从而使细胞裂解。利用高静压技术对猪角膜进行脱细胞处理，能够有效去除细胞，并且保持了胶原纤维的排列结构，同时减少糖胺聚糖（GAG）的损失。此外，HHP技术在处理过程中不添加去污剂，没有细胞毒性，脱细胞的同时去除了角膜中的细菌和病毒。然而这项技术需要昂贵的专业设备，制备成本高，因而限制了其引用和发展。2化学制备方法2.1去污剂处理法5离子型去污剂能够破坏蛋白与蛋白之间的连接结构，从而使得蛋白质发生变性作用。最常用的离子型去污剂是十二烷基磺酸钠（SDS），其作为生物膜的溶解剂，能够有效去除组织中的细胞成分。Du等[1]研究表明

4、0.5%～1%SDS能够有效去除细胞，且不破坏ECM的天然组织结构。然而，SDS处理会降低GAG的总含量，损伤基底膜，并且造成胶原结构松散。非离子型去污剂不破坏蛋白与蛋白之间的连接，而只是破坏脂质与脂质之间和脂质与蛋白之间的结构，且作用温和，已被广泛应用于脱细胞研究中。其中最常用的非离子型去污剂是TritonX-100。陈苹等[2]研究发现1%TritonX-100能够有效去除角膜基质中的细胞成分，并且能够维持胶原纤维结构。但也有研究报道浓度为5%的TritonX-100对角膜的脱细胞效果不佳[1]。两性离子型去污剂能够增溶膜蛋白并破坏蛋白-蛋白之间的相互作用，具有离子型及非离子型去

5、污剂的双重特性。其中最常用的两性离子去污剂为CHAPS。但Du等[1]利用该去污剂处理猪角膜，发现去除角膜细胞的效果较差，角膜基质中常会残留细胞碎片。2.2酸、碱处理法酸、碱通常与去污剂和醇类结合使用，能够引起或是促进生物分子的水解。PonceMárquez等[3]使用过氧乙酸联合乙醇对牛角膜进行脱细胞处理，但是脱细胞效果并不理想，组织边缘仍有细胞残留，说明该方法仍有待改进。2.3高渗溶液、低渗溶液处理法利用高渗和低渗溶液能够使细胞内的渗透压发生变化，如使用去5离子水、低离子强度的溶液导致组织的细胞松解和细胞膜的破裂，从而达到脱细胞的目的。该方法操作简便，对组织的形态结构破坏不明显，

6、但是脱细胞效果不佳，且所需时间较长，故很少单独应用。3酶消化法酶消化法主要用于对去污剂未去除干净的细胞成分进行进一步清除，主要包括蛋白酶和核酸酶。最常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶和中性蛋白酶。胰蛋白酶能够溶解变性的蛋白质，从而破坏细胞的结构。在多项研究中，胰蛋白酶被用于分散角膜的ECM结构，以利于之后的脱细胞试剂渗透进入角膜内部。此外，磷脂酶A2能够水解细胞的磷脂成分，因而也被应用于脱细胞处理，并取得了良好的脱细胞效果，但是角膜处理后GAG含量会显著降低。4血清处理法血清中含有核酸酶，能够降解DNA和RNA。Shao等[4]首先提出单纯用人血清对猪角膜进行脱细胞处理。之后，其改进了方法，

7、将人血清处理与电泳法相结合。先将猪角膜在无菌的100%人血清中孵育1天，之后对角膜进行电泳。该方法能够完全去除细胞，并且保持了角膜的透明度。5结语5脱细胞角膜基质是构建组织工程角膜理想的生物材料，具有优良的生物相容性和组织相容性。要获得比较理想的脱细胞效果，同时最大程度地保留原有组织结构，通常需要多种脱细胞方法联合应用。建议应用最温和的方法进行处理，从而将脱细胞过程对ECM的结构、功能产生的影响降低到最小程度。一般先在高渗或低渗溶液浸泡，随后用去污剂处理，