兔主动脉脱细胞血管基质的制备

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1、兔主动脉脱细胞血管基质的制备：林明山池一凡侯文明孙忠东牛兆倬孙勇生伟孙龙【摘要】目的研究脱细胞血管基质的制备方法。方法采用胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔胸主动脉制备脱细胞血管基质,标本经苏木精伊红染色光镜观察，20g/L戊二醛固定做扫描电镜、透射电镜观察。结果光镜下血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维呈网状排列,细胞已全部除去;扫描电镜观察血管脱细胞组织基质纤维结构完整,胶原纤维无断裂,呈网状和多孔状,孔径（100～150）μm×（10～20）μm;透射电镜观察示胶原和弹性纤维无断裂,基底膜面光滑完整,无破裂。结论胰蛋白酶、低渗溶液、化学除垢剂联合法处理兔主动脉,可使血管细

2、胞全部脱除,胶原纤维、弹性纤维无断裂，细胞外基质保持完好。【关键词】细胞外基质;主动脉；胰蛋白酶　目前,应用组织工程技术制备血管移植材料成为血管移植手术研究的热点[1，2]。组织工程血管的制备主要包括血管支架材料的研制、体外细胞培养和种植。可以用作组织工程血管的支架材料主要有体内可降解的人工合成材料和从天然组织中制备获得的材料。人工合成材料如聚乙二醇酸(PGA)、聚丙醇酸(PLA)等,有较好的生物相容性、可塑性和可降解性,但其工艺复杂。从天然组织中制备获得的材料如血管脱细胞组织基质(ACTM)因含有特殊氨基酸序列等,可促进细胞吸附或保留分化功能,因此,作为天然生物支架材料逐渐受到人们重视[

3、3]。本文采用酶、低渗溶液和化学除垢剂相结合的方法制备兔主动脉脱细胞血管基质，为进一步应用于临床提供依据。　　1材料和方法　　1.1实验材料　　实验动物:取健康普通家兔1只,雄性,2月龄，体质量560g。主要仪器有:S840扫描电镜（日本JEOL公司）、JEM1200EX透射电镜（日本JEOL公司）。试剂主要有:1.25g/L的胰蛋白酶(Sigma公司)、体积分数0.01的TritonX100(Sigma公司)、10g/L十二烷基硫酸钠(SDS,Sigma公司)、磷酸盐缓冲液(Sigma公司)、Hank’s液(Sigma公司)。　　1.2实验方法　　1.2.1动物血管采取家兔耳缘静脉

4、注射空气致死，无菌条件下开胸取其胸主动脉,长8cm,直径0.35cm，置入培养皿中，加入Hank液冲洗干净，用眼科剪、镊剥去外层结缔组织及外膜。　　1.2.2细胞脱除方法将获取的血管放入15mL离心管中，加入含双抗的1.25g/L的胰蛋白酶6～8mL作用4h,然后用PBS冲洗3次,去离子水作用12h,体积分数0.01的TritonX100溶液作用24h,PBS冲洗3次，去离子水作用4h,最后采用10g/L的SDS作用24h,PBS冲洗3次,含双抗的Hank液冲洗4h后保存。以上步骤均在37℃恒温震荡器中进行。　　1.2.3脱细胞血管基质的观察将制取的脱细胞血管基质用40g/L的甲醛固定，

5、苏木精伊红染色，光镜观察细胞脱除情况;用20g/L的戊二醛固定,扫描电镜、透射电镜观察细胞脱除情况及胶原纤维和弹性纤维情况。　　2结果　　2.1大体观察　　血管剥除外膜后，管壁弹性良好，管腔无塌陷，内膜面光滑完整。脱细胞处理后，血管呈乳白色，管壁无破损，管腔无塌陷。　　2.2光镜观察　　处理前的血管壁中有大量核蓝染的细胞存在,亮红色、波浪状平行排列的胶原纤维清晰可见。血管脱细胞组织基质中胶原纤维和弹性纤维保持原来的形态和结构,呈网状排列,其中细胞已全部被除去(图A、B)。　　2.3扫描电镜观察　　血管脱细胞组织基质纤维结构完整,胶原纤维无断裂,呈网状和多孔状,孔径（100～150）μm×

6、（10～20）μm(图C、D)。　　2.4透射电镜观察　　胶原、弹力纤维呈网状排列,纤维无断裂,基底膜面光滑完整,无破裂(图E、F)。　　3讨论　　合适的支架材料对于构建组织工程血管十分重要,脱细胞血管基质是采用动物血管,经脱细胞处理后而获得的一种生物材料,它不仅去除了血管原有的免疫原性，保持了血管的原有形态和物理性能,而且保存了细胞识别的结合位点,易于种子细胞的种植和吸附[4～6]。目前,脱细胞组织基质已应用于膀胱、口腔黏膜、骨等器官的重建[7～9]。1990年,支架,经多步骤的脱细胞处理,组织中的可溶性蛋白及细胞成分被除去,保留下来的是具有完整外观形态和组织学及超微结构的不可溶成分,主

7、要包括胶原、弹性蛋白、氨基葡聚糖、结构蛋白等。脱细胞的方法主要有酶消化法和去污剂法。本文采用酶、低渗溶液和化学除垢剂联合的方法,多步骤处理血管获得脱细胞血管基质:先用胰蛋白酶对血管壁中的某些基质进行溶解，破坏其细胞的完整性，然后用低渗溶液进一步导致细胞溶胀、破裂[11]。BOOTH等[12]仅用0.3g/L的SDS就能将心脏瓣膜中的细胞完全除去,且胞外基质保存完好。RIEDER等[13]的研究也表明，使用1g/L的SDS